泛素-蛋白酶体系统在T细胞免疫和哮喘中的作用①

宋慧慧 时国朝 (上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科，上海 200025)

1 泛素-蛋白酶体系统的结构及其功能

蛋白的翻译后修饰与基因的转录和翻译一起共同调节蛋白的表达水平和活性，常见的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化等。泛素化是蛋白翻译后修饰的一种，可对细胞功能进行广泛而复杂的调控。泛素化是指在泛素活化酶(Ubiquitin activating enzyme，E1)、泛 素 结 合 酶 (Ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶 (Ubiquitin protein ligase，E3)的连续作用下，泛素被连接到目标蛋白上，标记蛋白进入蛋白酶体降解或改变蛋白的活性。泛素化是可逆的，去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme，DUB)对泛素化进行负向调节。泛素、E1、E2、E3和蛋白酶体、DUB构成了泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system，UPS)［1］。UPS对底物作用的特异性主要由泛素修饰类型、E3和DUB决定。

首先，泛素是一个由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽，含有不同位点的七个赖氨酸残基(Lysine，K)—K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63。在酶的催化下，泛素的C端最终与靶蛋白的K的ε-N端形成异肽键，少数情况下，底物的丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸残基也是泛素结合位点。蛋白的泛素化连接可以是单个泛素或聚泛素链(即泛素持续加入与原有泛素的K形成异肽键)，前者称为单泛素化，后者称为聚泛素化。值得注意的是，原有泛素的七个K都可成为新加入泛素的连接位点，因此造成空间构象各异的聚泛素链，各自介导不同的功能［2］。K48聚泛素化是最常见的泛素修饰类型，通常情况下，K48聚泛素化介导靶蛋白的蛋白酶体降解。K63聚泛素化一般介导非降解功能，但是受体酪氨酸激酶的K63聚泛素化标记其进入溶酶体降解途径。K11聚泛素化介导细胞周期蛋白的降解，单泛素化主要调控组蛋白和染色质结构改变［3］。

三种催化酶中，E3在特异识别底物中最重要，相关研究也最多。E3包括含有HECT(Homologous to the E6-associated protein C-terminus，HECT)家族、RING(Really interesting new gene，RING)家族和 U-box家族。RING家族成员最多，可以是单体、二聚体或多亚基复合物，如含有 F-box蛋白的 SCF(SKP1-Cullin1-F-Box)。E3内部含有特异识别某一类底物的结构域，如 Cbl(Casitas B-lineage lymphoma)的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域，NEDD4的WW结构域识别上皮细胞钠通道的PY基序，HSC70羧基末端反应蛋白(Carboxy terminus of Hsc70 interacting protein，CHIP)的TRP结构域识别HSP70、HSC70、HSP90等。E3参与调节多种细胞功能，如抑制细胞凋亡、调控细胞周期、下调酪氨酸激酶信号、参与蛋白质量控制、调节抑癌蛋白等［4］。E3还可催化自身和其他E3的泛素化，由此形成自我调节和自稳的网络［5］。

DUB可划分为五类:泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin specific protease，USP)、泛素羧基端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢瘤蛋白酶(Ovarian tumor protease，OTU)、约瑟芬结构域蛋白酶(Machado-Josephin domain protease，MJD)、JAB1/MPN/MOV34金属蛋白酶(JAB1/MPN/MOV34 metalloprotease，JAMM)，前四类均是半胱氨酸蛋白酶。USP是DUB中最大的一类，现有研究也主要是关于USP的。DUB可去除泛素化蛋白和泛素化E3的泛素修饰，与E3共同调节细胞内的泛素化平衡。研究表明DUB在NF-κB及TGF-β信号通路、膜受体内吞循环、转录调控和DNA修复中起到十分重要的作用［6］。

既往研究证明UPS参与恶性肿瘤、炎症性疾病、神经退行性变如帕金森病、心血管疾病的发病。下面，我们将着重介绍UPS在T细胞免疫和哮喘发病中的研究进展。

2 泛素-蛋白酶体系统与T细胞的关系(见表1)

2．1 CD4+T细胞活化 E3 Cbl、肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)均可负向调节 T细胞活化。Chang等［7］发现E3 Peli1介导哺乳动物核因子-κB(Nuclear factorκB，NF-κB)家族成员 c-Rel的 K48泛素化和降解，负向调控T细胞活化并抑制自身免疫的发生。Cai等［8］发现E3三重基序蛋白27(Tripartite motif containing protein 27，TRIM27)通过泛素化Ⅱ类磷脂酰肌醇 3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)PI3KC2β，抑制它的激酶活性，负向调控CD4+T细胞活化。Nurieva等［9］研究表明E3 GRAIL(Gene related to anergy in lymphocytes)介导T细胞活化后期内吞CD3的泛素化降解并抑制活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)家族成员NFATc1的表达，从而限制T细胞过度活化。

2．2 Th1细胞 Cui等［10］发现黄连素可诱导非肥胖型糖尿病小鼠的1型辅助性T细胞(helper T lymphocyte 1，Th1)转录因子STAT4的泛素化降解，进而影响Th1的分化。Kriegel等［11］发现在E3 GRAIL缺陷小鼠体内，Th1细胞因子IFN-γ分泌增加，胞外调节蛋白激酶1/2(Extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)的蛋白水平和磷酸化水平上升，ERK可能是GRAIL的调节靶点。

2．3 Th2 细胞 Swaidani等［12］发现 E3 Act1 可通过共有的SEFIR(Similar expression to FGF genes and IL-17R)结构域与IL-25受体相互作用，参与IL-25诱导的Th2免疫反应和气道过敏反应。IL-33可诱导Th2细胞反应并介导肺部炎症。Funakoshi-Tago等［13］发现E3 TRAF6是IL-33受体ST2L与下游信号分子间的衔接蛋白，失去泛素连接酶活性的TRAF6导致 IL-33诱导 p38、JNK和 IκB磷酸化受阻。Zhao等［14］发现 E3 FBXL19介导 IL-33受体ST2L的泛素化降解，缓解IL-33诱导的肺部炎症。

2．4 Th17细胞 Espinosa等［15］发现 E3 Ro52可介导干扰素调节因子(Interferon regulatory factor，IRF)家族成员的泛素化，负向调节Th17细胞因子的生成。Nurieva等［9］研究表明E3 GRAIL抑制调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)中 IL-17、IL-21、ROR γ编码基因的表达，维持Treg的免疫抑制功能。

2．5 Foxp3 和 Treg细胞 Venuprasad 等［16］也发现E3 Itch使转化生长因子-β诱导早期基因1(Transforming growth factor-β-inducible early gene 1，TIEG1)泛素化，促进TIEG1与Foxp3基因启动子的相互作用，增强Foxp3基因转录。Chang等［17］发现特异性剔除Treg中的E2 Ubc13后，Treg的免疫抑制功能下降且促使Treg向Th1和Th17转化，可能是由于Ubc13促进 IκB激酶(InhibitoryκB kinase，IKK)的泛素化降解并激活NF-κB，激活IL-10基因和细胞因子信号抑制物1(Supressor of cytokine signaling 1，SOCS1)基因的转录。

2．6 CD8+T 细胞 Hansen等［18］发现在 CD3γ 链的双亮氨酸基序变异的小鼠体内，E3 c-Cbl大量激活，引起鸟苷酸交换因子Vav1的泛素化降解，导致溶细胞颗粒物质胞吐受限，CD8+T细胞的细胞杀伤作用减弱。Hosoi等［19］发现与编码肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)的 mRNA 相比，编码泛素化TAAs的mRNA可增强TAAs的胞内降解和抗原提呈，加强TAA特异性CD8+T细胞的扩增。

表1 泛素-蛋白酶体系统在T细胞免疫中的作用及其机制Tab．1 The effect and mechnism of the ubiquitin-proteasome system in T cell immunity

3 泛素-蛋白酶体系统在哮喘发病机制中的作用(见表2)

3．1 过敏性哮喘 少数易感人群在接触过敏原后发生过敏或哮喘反应。Srivastava等［20］发现 E3 TRIM27负向调节肥大细胞的FcεRⅠ活化及其介导的过敏反应。Oh等［21］发现与野生型小鼠相比，Cblb缺陷小鼠受过敏原激发后，气道和肺组织的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润和黏膜增生更加严重，表现出Th1/Th2混合型免疫反应，但是Treg亚群无明显改变。Li等［22］发现在卵清蛋白致敏和激发的小鼠模型中，E3 Arkadia通过介导转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)信号通路负向调节因子Smad7、SnoN和Ski的泛素化降解，增强TGF-β信号转导，促进气道重塑。

3．2 HDAC2和激素抵抗性哮喘 糖皮质激素主要通过招募HDAC2至活化的炎症基因发挥其抗炎作用，激素抵抗性哮喘和抽烟哮喘患者体内HDAC2显著下降，恢复HDAC2的活性和表达水平是抑制激素抵抗和炎症反应的重要途径［23］。Adenuga等［24］发现巨噬细胞、肺上皮细胞接触香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract，CSE)后，引起 HDAC2 的泛素化降解增加。Meja等［25］发现姜黄素和MG132均可抑制CSE诱导的HDAC2的泛素化降解。以上研究表明，抑制HDAC2的泛素化可能逆转哮喘患者的激素抵抗。

表2 泛素-蛋白酶体系统在哮喘中的作用及其机制Tab．2 The effect and mechnism of the ubiquitinproteasome system in asthm a

3．3 RSV和儿童型哮喘 对于部分无特应性体质和家族史的儿童型哮喘患者，反复喘息发作与急性呼吸道病毒感染有关，如呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)和腺病毒。Tan等［3］发现 RSV非结构蛋白-1(Nonstructural protein-1，NS-1)对支气管上皮细胞组蛋白H2BD的泛素化修饰导致HOX基因(调控支气管发育)的异常表达，有可能是RSV感染后肺发育异常和哮喘发生的机制之一。

3．3 NOD2 胞内蛋白核苷酸结合寡聚化结构域2(Nucleotide binding and oligomerization domain 2，NOD2)与胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)结合可后激活NF-κB，下游信号分子的泛素化是该通路活化的重要一步。E3 TRAF4、Itch和去泛素化酶A20可负向调节 NOD2信号。由于过度活化的NOD2参与过敏性疾病和哮喘的发生，因此上述E3是否参与哮喘发病值得我们关注［26］。

4 泛素-蛋白酶体系统抑制剂

Hirose等［27］发现在抗原激发前对哮喘小鼠鼻内应用IκB泛素化抑制剂GS143可抑制抗原诱导的气道嗜酸性粒细胞浸润、嗜酸性粒细胞趋化因子和Th2细胞因子表达。Moutzouris等［28］发现使用蛋白酶体抑制剂MG-132预处理的人类气道平滑肌细胞受TNF-α激发后，气道重塑抑制因子MAPK磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1，MKP-1)泛素化降解下降，多种参与哮喘的细胞因子、趋化因子的分泌减少。但是，Wegmann等［29］运用慢性哮喘小鼠模型发现硼替佐米短期(一周)治疗可降低支气管肺泡灌洗液的嗜酸性粒细胞数，长期(六周)治疗显著降低慢性实验性哮喘小鼠的抗OVA IgE血清滴度。但是，无论是短期还是长期治疗都不能有效降低浆细胞数、抗OVA IgG1血清滴度、过敏性气道炎症或消除气道高反应性。

5 总结和展望

上述研究表明E3在T细胞免疫中的重要作用，鉴于哮喘发病机制中存在的 Th1/Th2失衡、Treg/Th17失衡以及CD8+T细胞的参与，E3对T细胞调控作用对哮喘发病的影响很值得我们进一步的探讨。上述研究只是关于一小部分E3对T细胞及哮喘的作用且没有深入探究E3作用的具体分子，由于E3种类繁多、作用广泛，研究其他E3及其特异靶蛋白有利于阐明哮喘的发病机制并做特异干预。尽管IκB泛素化抑制剂和蛋白酶体抑制剂可缓解哮喘模型小鼠的过敏性炎症，但是效果并不显著，极可能是其特异性不高。未来，在研究哮喘发病的关键信号通路和相关E3的基础上，根据相关E3的特异底物结合域，设计出“假底物”干扰信号转导或许可以为哮喘的治疗提供启示。

1 Kim H M，Yu Y，Cheng Y．Structure characterization of the26Sproteasome［J］．Biochim Biophys Acta，2011;1809(2):67-79．

2 Kravtsova-lvantsiv Y，Ciechanover A．Non-canonical ubiquitin-based signals for proteasomal degradation［J］．J Cell Sci，2012;125(Pt 3):539-548．

3 Tan Y R，Peng D，Chen CM etal．Nonstructural protein-1 of respiratory syncytial virus regulates HOX gene expression through interacting with histone［J］．Mol Biol Rep，2013;40(1):675-679．

4 MetzgerM B，Hristova V A，Weissman A M．HECT and RING finger families of E3 ubiquitin ligasesata glance［J］．JCell Sci，2012;125(Pt3):531-537．

5 de Bie P，Ciechanover A．Ubiquitination of E3 ligases:selfregulation of the ubiquitin system via proteolytic and non-proteolytic mechanisms［J］．Cell Death Differ，2011;18(9):1393-402．

6 Clague M J，Coulson JM，Urbe S．Cellular functions of the DUBs［J］．JCell Sci，2012;125(Pt2):277-286．

7 Chang M，Jin W，Chang JH et al．Peli1 negatively regulates T-cell activation and prevents autoimmunity［J］．Nat Immunol，2012;12(10):1002-1009．

8 Cai X，Srivastava S，Sun Y et al．Tripartitemotif containing protein 27 negatively regulates CD4 T cells by ubiquitinating and inhibiting the class II PI3K-C2β［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2011;108(50):20072-20077．

9 Nurieva R I，Zheng S，Jin W et al．The E3 ubiquitin ligase GRAIL regulates T cell tolerance and regulatory T cell function by mediating T cell receptor-CD3 degradation［J］．Immunity，2010;32(5):670-680．

10 CuiG，Qin X，Zhang Y etal．Berberine differentiallymodulates the activities of ERK，p38 MAPK，and JNK to suppress Th17 and Th1 T cell differentiation in type 1 diabetic mice［J］．J Biol Chem，2009;284(41):28420-28429．

11 KriegelM A，Rathinam C，Flavell R A．E3 ubiquitin ligase GRAIL controls primary T cell activation and oral tolerance［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(39):16770-16775．

12 Swaidani S，Bulek K，Kang Z et al．T cell-derived Act1 is necessary for IL-25-mediated Th2 responses and allergic airway inflammation［J］．J Immunol，2011;187(6):3155-3164．

13 Funakoshi-Tago M，Tago K，Hayakawa M etal．TRAF6 is a critical signal transducer in IL-33 signaling pathway［J］．Cell Signal，2008;20(9):1679-1686．

14 Zhao J，Wei J，Mialki R K et al．F-box protein FBXL19-mediated ubiquitination and degradation of the receptor for IL-33 limits pulmonary inflammation［J］．Nat Immunol，2012;13(7):651-658．

15 Espinosa A，Dardalhon V，Brauner S et al．Loss of the lupus autoantigen Ro52/Trim21 induces tissue inflammation and systemic autoimmunity by disregulating the IL-23-Th17 pathway［J］．J Exp Med，2009;206(8):1661-1671．

16 Venuprasad K，Huang H，Harada Y et al．The E3 ubiquitin ligase Itch regulates expression of transcription factor Foxp3 and airway inflammation by enhancing the function of transcription factor TIEG1［J］．Nat Immuol，2008;9(3):245-253．

17 Chang JH，Xiao Y，Hu H et al．Ubc13 maintains the suppressive function of regulatory T cellsand prevents their conversion into effector-like T cells［J］．Nat Immunol，2012;13(5):481-490．

18 Hansen A K，Regner M，Bonefeld CM et al．TCR down-regulation boosts T-cell-mediated cytotoxicity and protection against poxvirus infections［J］．Eur J Immunol，2011;41(7):1948-1957．

19 Hosoi A，Takeda Y，Sakuta K et al．Dendritic cell vaccine with mRNA targeted to the proteasome by polyubiquitination［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008;371(2):242-246．

20 Srivastava S，Cai X，Li Z et al．Phosphatidylinositol-3-kinase C2beta and TRIM27 function to positively and negatively regulate IgE receptor activation ofmast cells［J］．Mol Cell Biol，2012;32(15):3132-3139．

21 Oh SY，Park JU，Zheng T et al．Cbl-b regulates airway mucosal tolerance to aeroallergen［J］．Clin Exp Allergy，2011;41(3):434-442．

22 Li X Z，Feng JT，Hu C P et al．Effects of Arkadia on airway remodeling through enhancing TGF-beta signaling in allergic rats［J］．Lab Invest，2010;90(7):997-1003．

23 Barnes P J．Targeting the epigenome in the treatment of asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］．Proc Am Thorac Soc，2009;6(8):693-696．

24 Adenuga D，Yao H，March T H et al．Histone deacetylase 2 is phosphorylated，ubiquitinated，and degraded by cigarette smoke［J］．Am JRespir Cell Mol Biol，2009;40(4):464-473．

25 Meja K K，Rajendrasozhan S，Adenuga S etal．Curcumin restores corticosteroid function in monocytes exposed to oxidants by maintaining HDAC2［J］．Am JRespir Cell Mol Biol，2008;39(3):312-323．

26 Tigno-Aranjuez J T， Abbott D W． Ubiquitination and phosphorylation in the regulation of NOD2 signaling and NOD2-mediated disease［J］．Biochim Biophys Acta，2012;1823(11):2022-2028．

27 Hirose K，Wakashin H，OkiM et al．GS143，an IkappaB ubiquitination inhibitor，inhibits allergic airway inflammation in mice［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008;374(3):507-511．

28 Moutzouris JP，Che W，Ransay E E et al．Proteasomal inhibition upregulates the endogenous MAPK deactivator MKP-1 in human airway smooth muscle:mechanism of action and effect on cytokine secretion［J］．Biochim Biophys Acta，2010;1803(3):416-423．

29 Wegmann M，Lunding L，Orinska Z et al．Long-Term Bortezomib Treatment Reduces Allergen-Specific IgE but Fails to Ameliorate Chronic Asthma in Mice［J］．Int Arch Allergy Immunol，2012;158(1):43-53．