初步探讨中国广东人群的中性粒细胞CD177基因型和HNA-2a的表达①

徐秀章 夏文杰 叶 欣 丁浩强 陈扬凯 邓 晶 邵 媛 王嘉励

(广州血液中心临床输血研究所，广州 510095)

人类中性粒细胞除表达人类白细胞抗原、红细胞ABH抗原等共有抗原外，还表达特有的糖蛋白，称为中性粒细胞抗原(Human neutrophil antigen，HNA)。自1960年 Lalezari［1］发现首个人类中性粒细胞抗原以来，目前已检出并命名了HNA1～5系统中的8个HNA抗原。研究证明［2］，中性粒细胞抗原在中性粒细胞的免疫激活和输血相关性疾病方面起着重要作用，其抗体可导致多种临床病症，如同种免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、药物依赖性中性粒细胞减少症、骨髓移植后移植物被排斥及输血相关性急性肺损伤(TRALI)。在HNA系统中，人类中性粒细胞抗原－2a(HNA－2a)因其临床重要性而受到广泛关注。

HNA－2a之前被称为 NB1，由 19号染色体19q13．3区域的 CD177基因编码，分子量为56－64 kD。CD177基因的cDNA由1 311个碱基组成，编码437个氨基酸，其中包括21个氨基酸的信号肽［3］。NB1糖蛋白属于LY6基因家族，且与Ly－6基因家族的另一成员PRV－1具有高度的同源性，目前已被证实是一对等位基因［4］。PRV－1基因在真性红细胞增多症患者的中性粒细胞上大量表达，且与NB1基因之间存在4个碱基的区别，其中外显子1第42位置上的碱基取代决定HNA－2a系统的抗原特异性，故多通过该位置对中性粒细胞的CD177进行基因分型。HNA－2a是一种高频率抗原，其中在97%的高加索人、95%的非裔美国人及99．5%的日本中表达［4－7］。有3% ～5%的健康人表达非常低的HNA－2a，甚至有极少部分表达量＜5%，称为 HNA－2－null型。目前认为 HNA－2－null型的产生与 mRNA合成过程中的剪切错误有关［2］。在HNA－2a表达阳性的个体中，并非所有的中性粒细胞都表达HNA－2a。在0%－100%范围内的中性粒细胞有不同程度的 HNA－2a 表达(55% ±22%)［8］，且其表达量受多种因素的影响，研究发现 CD177基因的 SNPs与HNA－2a的表达水平相关。

本研究旨在通过PCR－SBT方法对中性粒细胞CD177(G42C)基因型进行检测，获得中国广东人群的CD177的基因型;同时也采用流式细胞技术检测该人群HNA－2a的表达，结合其基因型对可能影响HNA－2a表达的几个因素(SNPs、年龄及性别)进行初步探讨。

1 对象与方法

1．1 研究对象 随机抽取83份体检正常的无血缘关系的广东籍无偿献血者，其中男53例，女30例，年龄介于20～54岁。每例标本抽取EDTA抗凝血10 ml。

1．2 主要仪器和材料 淋巴细胞分离液(密度ρ:1．077±0．002)购自上海华精生物高科技有限公司;DPBS购自广州英韦创津生物科技有限公司;CD177－FITC(MEM－166)和鼠抗 IgG－FITC 抗体均购自美国BioLegend公司;EPICS－XL流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司;MJPTC－200PCR扩增仪;全血DNA提取试剂盒(购自德国QIAGEN公司);凝胶成像系统(美国UVP);3130测序仪(购自美国ABI公司)。

1．3 方法

1．3．1 中性粒细胞分离 将2 ml生理盐水加入新鲜采集的全血中，混匀，再缓慢加入4 ml的淋巴细胞分离液中，2 000 r/min，离心20分钟。弃上层血清及淋巴细胞，洗涤后加入1×氯化铵溶血素，冰上裂解5分钟，1 500 r/min离心5分钟，如红细胞裂解不充分，可进一步裂解。用DPBS洗涤2次后，用1 ml的0．2%BSA/DPBS重悬，上机计数并将中性粒细胞的浓度调整为 3×106ml－1。

1．3．2 流式细胞仪检测 分别取1．3．1中的粒细胞悬液100μl加入到两支FACS管中，一管再加入2μl的MEM－166，另一管加入2μlm IgG(每个样本均设有对照管)，4℃避光孵育20分钟。之后加入2．5 ml的 0．2%BSA/DPBS，以 1 500 r/min 离心 5分钟，弃上清。最后用300μl的0．2%BSA/DPBS重悬细胞，上机读数。

1．3．3 基因组 DNA提取 EDTA抗凝静脉血5 ml，按试剂盒提取DNA(详细步骤见QIAGEN DNA提取试剂盒说明书)，－20℃保存。

1．3．4 PCR扩增及测序 合成PCR扩增引物:5HNA－2a:5'－GAGAGATTACCAGCCACAGACG－3';3HNA－2a:5'－GCACAGGGATCAAGGGAC－3'。 扩 增条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，63℃退火30秒和72℃延伸30秒，共30循环，72℃最后延伸5分钟后冷却至4℃。对扩增的PCR产物进行酶切纯化后，将扩增引物作为测序引物进行测序PCR，反应条件如下:96℃预变性2分钟，96℃变性10秒，50℃退火5秒和60℃延伸4分钟，共25循环。纯化变性后上机测序。

1．4 统计学分析 用SPSS13．0软件进行统计学分析。对83例CD177基因型测序结果和HNA－2a表达量的流式检测结果进行T－检验和单因素方差分析，若P＜0．05，认为有统计学意义。

2 结果

2．1 广东人群中中性粒细胞HNA－2a的表达与年龄及性别的关系 通过流式细胞术对83名广东籍无偿献血者HNA－2a的表达进行检测，其表达量均超过5%(HNA－2a表达量低于5%，认为HNA－2a表达阴性)。HNA－2a在83例献血者的中性粒细胞表达的百分比为61．37%±17．87%，MFI为4．87±1．41(见表 1、图 1)。对不同性别及女性不同年龄段(≥40岁者与＜40岁者)HNA－2a的表达量进行T－检验，P＞0．05，统计结果表明，男性与女性对HNA－2a的表达无明显差异，且女性随着年龄的增加对HNA－2a的表达量亦无明显影响。

表1 不同性别及年龄对HNA-2a表达的影响Tab．1 The effects of gender and age on HNA-2a expression in Guangdong population

表2 CD177的基因型及HNA-2a流式表达结果Tab．2 CD177 genotype and the results of HNA-2a exp ression by flow cytometry

2．2 中国广东人群 CD177的基因型及 SNPs对HNA－2a表达的影响 根据CD177基因在1号外显子42位的单核苷酸多态性(SNPs)，采用PCR－SBT法对83份标本的 CD177进行基因分型，表现为42C/C、42C/G和42G/G三种基因型，其中42C/C与42C/G为中国广东人群中常见的CD177基因型，分别占48．19%与44．58%;而42G/G较少见，仅占7．23%(见表2、图2)。

此外，对不同基因型的无偿献血者 HNA－2a的表达量进行单因素方差分析(见表2)，统计显示，42C/C与42G/G基因型之间，其 HNA－2a表达的MFI存在显著影响(P=0．047＜0．05)，表明 G42C 基因多态性可影响HNA－2a的表达。

3 讨论

图1 HNA-2a表达的流式细胞分析结果Fig．1 Flow cytometry of HNA-2a expression

图2 HNA-2a基因分型测序结果Fig．2 The genotype of HNA-2a analyzed by nucleotide sequencing

HNA－2a作为GPⅠ连接膜糖蛋白仅表达于中性粒细胞亚群［9，10］，且表达存在明显的个体差异。研究认为可能与以下两个机制有关［4，11－15］:一，机体状态的影响，激素、炎症、感染、接受G－CSF治疗及骨髓增生性疾病等因素可影响CD177的基因调控和蛋白加工，从而导致HNA－2a表达增加。据文献报道HNA－2a在中性粒细胞的表达，女性高于男性，特别是妊娠期妇女HNA－2a中性粒细胞数明显增加［12］。二，基因水平的影响，CD177是一个多态性基因，一些高频的SNPs可能会影响到中性粒细胞表面的蛋白表达，例如 G42C。A793C及 G1084A等，其中最常见的SNPs为G42C，单核苷酸其多态性使得参与细胞从内质网到质膜和次级颗粒进行蛋白搬运的前导序列的氨基酸发生改变，从而影响到细胞表面蛋白质的表达量［16］。

本研究首先采用流式细胞术检测中国广东人群HNA－2a的表达，发现 83例无偿献血者均表达HNA－2a 抗原，其表达量为61．37% ±17．87%。本实验也对HNA－2a在不同性别及女性的不同年龄段的表达量进行相关性分析，统计结果显示女性与男性之间HNA－2a的表达量无差异，且 HNA－2a在≥40岁与＜40岁女性中性粒细胞之间的表达无明显区别，此与之前文献报道的不一致［12］。分析原因可能与本实验样本量少有关;亦或者雌激素并不影响HNA－2a的表达。其次，通过对83名健康无偿献血者CD177基因(G42C)进行测序分析，获得中国广东人群基因型结果是42C/C和42C/G多见，而42G/G 少见，分别占 48．19%、44．58%和 7．23%。而Caruccio等［4］得到的实验结果是42G/G与42C/C 多见，42C/G 较少见，分别占50．00%、43．75%及6．25%，两者结果存在很大差异，分析原因可能与人种不同有关。因为本研究着眼于位于中国南方地区的广东人群，而Caruccio等研究人群则由11名非裔美国人和12名高加索人组成，两者在人种遗传和地域等方面存在很大差距，故初步推测中国广东人群CD177基因的G42C存在其独特性。本研究亦分析CD177基因的G42C多态性对HNA－2a表达量的影响，统计数据显示，42C/C基因型献血员其HNA－2a表达的MFI明显高于42G/G基因型者(P＜0．05)，表明SNPs(G42C)会影响HNA－2a的表达量。

总之，NB1作为最重要的中性粒细胞抗原之一是目前输血免疫领域研究的热点，其临床重要性在国外得到广泛地关注，但国内对HNA－2a的研究甚少。本研究通过PCR－SBT方法和流式细胞术，获得了中国广东人群CD177的基因型及HNA－2a的表达情况，并对影响HNA－2a表达的几个因素进行了初步探讨，这对今后对NB1功能研究及由NB1引起的临床输血相关性疾病的研究提供了理论基础。

1 Lalezari P，Nussbaum M，Gelman S et al．Neonatal neutropenia due tomaternal isoimmunization［J］．Blood，1960;15(2):236－243．

2 Bux J．Human neutrophil alloantigens［J］．Vox Sang，2008;94(4):277－285．

3 Kissel K，Scheffler S，Kerowgan M et al．Molecular basis of NB1(HNA－2a， CD177)deficiency［J］． Blood，2002;99(11):4231－4233．

4 Caruccio L，Walkovich K，BettinottiM etal．CD177 polymorphisms:correlation between high－frequency single nucleotide polymorphisms and neutrophil surface protein expression［J］．Transfusion，2004;44(1):77－82．

5 Bux J．Molecular genetics of granulocyte polymorphisms［J］．Vox Sang，2000;78(Suppl 2):125－130．

6 Taniguchi K，KobayashiM，Harada H et al．Human neutrophil antigen－2a expression on neutrophils from healthy adults in western Japan［J］．Transfusion，2002;42(5):651－657．

7 Moritz E，Chiba A K，Yamamoto M etal．Human neutrophil antigen－2a expression in the Brazilian population［J］．Transfusion，2008;48(Suppl2):179A．

8 Matsuo K，Lin A，Procter J L et al．Variations in the expression of granulocyte antigen NB1［J］．Transfusion，2000;40(6):654－662．

9 Goldschmeding R，van Dalen CM，Faber N etal．Further characterization of the NB1 antigen as a variably expressed 56－62 kD GPI－linked glycoprotein of plasmamembranes and specific granules ofneutrophils［J］．Br JHaematol，1992;81(3):336－345．

10 Clement L T，Lehmeyer JE，Gartland G L．Identification of neutrophil subpopulations with monoclonal antibodies［J］．Blood，1983;61(2):326－332．

11 Wolff J，Brendel C，Fink L et al．Lack of NB1 GP(CD177/HNA－2a)gene transcription in NB1 GP－ neutrophils from NB1 GP－expressing individuals and association of low expression with NB1 gene polymorphisms［J］．Blood，2003;102(2):731－733．

12 Caruccio L，BettinottiM，Matsuo K etal．Expression of human neutrophil antigen－2a (NB1)is increased in pregnancy ［J］．Transfusion，2003;43(3):357－363．

13 Taniguchi K，Nagata H，Katsuki T et al．Significance of human neutrophil antigen－2a(NB1)expression and neutrophil number in pregnancy［J］．Transfusion，2004;44(4):581－585．

14 Göhring K，Wolff J，Doppl W et al．Neutrophil CD177(NB1 gp，HNA－2a)expression is increased in severe bacterial infections and polycythaemia vera［J］．Br JHaematol，2004;126(2):252－254．

15 Passamonti F，Pietra D，Malabarba L et al．Clinical significance of neutrophil CD177 mRNA expression in Ph－negative chronic myeloproliferative disorders［J］．Br JHaematol，2004;126(5):650－656．

16 Anjos S，Nguyen A，Ounissi－Benkalha H et al．A common autoimmunity predisposing signal peptide variantof the cytotoxic T－lymphocyte antigen 4 results in inefficient glycosylation of the susceptibility allele［J］．JBiol Chem，2002;277(48):46478－46486．