抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定

周 云，包 林，金 秋，张 黎，蔡雪婷，卢悟广，曹 鹏，焦永军，张建平

(1南京医科大学第二附属医院，南京210011;2卫生部肠道病原微生物重点实验室，江苏省疾病预防控制中心病原微生物研究所;3江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室)

结缔组织生长因子(CTGF)是典型CCN家族(Cyr61，CTGF，Nov)中的一员，其主要功能有促进细胞的迁徙、黏附、细胞外基质(ECM)的生成以及调节细胞周期、分化、伤口的愈合［1］。CTGF存在于许多人体组织中，主要由皮肤成纤维细胞、肾小球系膜、肝星状细胞、肺成纤维细胞、血管平滑肌细胞等合成分泌［2］。CTGF具有明显的有丝分裂原性和趋化性，可以调节成纤维细胞和系膜细胞外基质的分泌，在多种组织器官(如肾、肝、肺、皮肤等)纤维化的进程中起重要作用［3～5］。除了促进一些组织器官纤维化外，CTGF在恶性肿瘤的发生、发展和侵袭、转移中发挥重要作用［6～9］。目前，针对 CTGF的单克隆抗体治疗胰腺癌已应用于裸鼠的体内实验，其对糖尿病肾病的治疗也进入一期临床试验，都取得了良好的效果。因此，CTGF的特异性抗体应用于临床治疗具有广阔的前景。2012年4～10月，我们通过噬菌体展示技术筛选出了高亲和力的抗CTGF单链抗体，为临床CTGF相关疾病的研究和靶向治疗奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 人源ScFv抗体文库由本实验室建立并保存;重组人源TGF(rh-CTGF)购自英国PeproTech公司，大肠杆菌XLI-Blue、Top10F'、辅助噬菌体VCSM13购自Stratagene公司;HRP标记的抗M13抗体购自GE Healthcare公司，质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，SV40 MES13(小鼠肾小球系膜细胞)购自中科院细胞库，MHCC97H肝癌细胞系购自复旦大学医学院肝癌研究所。Millicell(8μm，24孔细胞培养板)购自美国Millipore公司，基质胶购自美国BD公司。

1．2 方法

1．2．1 抗CTGF噬菌体抗体的筛选 将含有人源ScFv基因的抗体库质粒 ScFv-pComb3xSS电转化XL1-Blue大肠杆菌，加辅助噬菌体M13KO7超感染制备噬菌体抗体文库;把该文库加入到包被有rh-CTGF酶标板中，37℃孵育2 h;PBST充分洗涤后，用Glycine-HCl(pH 2．2)洗脱。扩增阳性噬菌体抗体克隆，并进行下一轮筛选。共进行3轮筛选。计算每一轮筛选的洗脱与投入克隆的比例，观察筛选的富集程度。

1．2．2 CTGF特异性抗体克隆的鉴定 第3轮筛选后获得的噬菌体抗体克隆感染XLI-Blue后直接铺板(含氨苄青霉素)，37℃培养过夜。次日共挑200个单克隆分别置于LB培养基中，加入VCSM13辅助噬菌体超感染制备单克隆噬菌体抗体。离心后把含噬菌体抗体的上清液加入包被有rhCTGF的96孔酶标板，37℃孵育2 h;洗涤后加入HRP标记抗M13二抗，37℃孵育1 h;充分洗涤后加入HRP底物，室温作用30 min;每孔加H2SO4终止反应，于450 nm测吸光度。阳性克隆抽提噬粒DNA，对其编码ScFv的基因片段测序。

1．2．3 ScFv阳性克隆的表达、纯化 经 Phage-ELISA和DNA测序鉴定的阳性克隆，将其噬粒转化大肠杆菌Top10F'进行表达。挑单菌落置10 mL LB培养基(含氨苄青霉素)37℃培养过夜。次日用1 000 mL LB培养基1∶100稀释过夜培养物，37℃培养约6 h至A600nm=1．0，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，25℃ 诱导过夜。离心收集菌体沉淀，用6His亲和层析Binding buffer重悬后置超声波破碎菌体;离心取上清，过0．45μm微孔滤膜，进行镍柱亲和层析纯化。纯化的蛋白行SDS-PAGE观察纯度。用含8 mol/L尿素的Binding buffer重悬后，置超声波破碎菌体;超声裂解后，加1%Triton-100乳化;再次离心后收集上清，上His Trap亲和层析柱进行纯化;将洗脱目的蛋白稀释10倍后，用含有尿素的透析液进行透析复性，复性的尿素浓度梯度依次为 4、2、1、0．5、0．25、0．125 mmol/L(pH 7．5);透析完成后超滤管3 000 g浓缩蛋白，测定浓度后进行SDS-PAGE分析。

1．2．4 ScFv结合活性的鉴定 采用ELISA法。用rhCTGF包板，加入重组ScFv抗体分子，同时用肠道病毒71型病毒(EV71)特异性ScFv作为阴性对照，于37℃孵育2 h;充分洗涤后，加入HRP标记的抗6His标签抗体(表达的抗 rhCTGF和抗 EV71的ScFv均带有6His标签)，37℃孵育1 h;充分洗涤后，加底物室温显色30 min，加入1 mol/L H2SO450 μL/孔终止反应。以空白孔调零，在酶标仪读A450nm值。

1．2．5 Millicell迁移和侵袭实验 大量研究表明，肾小球系膜细胞可在多种因素影响下改变CTGF的表达量，且其细胞膜表面的CTGF受体使其对胞外活化CTGF的浓度相当敏感［10，11］。因此，我们选用小鼠肾小球系膜细胞的Millicell迁移实验来验证胞外活化CTGF浓度。小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES13在不含血清的DMEM/F12(3∶1)培养基内饥饿12 h，胰酶消化后用含0．1%FBS DMEM/F12培养基重悬细胞，按1．0×105/100μL加入上室。下室加入 600μL含 rhCTGF(550 ng/mL)+CTGF ScFv抗体(0、10、50、100 μg/mL)的 0．1%FBS DMEM/F12培养基，以EV71 ScFv作为抗体的阴性对照，以BSA作为CTGF的空白对照，常规培养20 h。棉签拭去上室内细胞，把膜风干，0．1%结晶紫染色10～30 min;显微镜下计数迁移细胞，计算迁移率(rhCTGF刺激组迁移率计为100%)。将基质胶按40μL/孔均匀地铺在 Millicell膜上，37℃成胶30 min，置紫外灯照射过夜。待培养的肿瘤细胞消化、计数，分别用空白、含EV71 ScFv 50μg/mL、含CTGF ScFv 50μg/mL DMEM无血清培养液(含0．1%BSA)稀释处理;2．0×105个细胞分别接种到铺有基质胶的上室内，下室加入5%FBS/DMEM，常规培养24 h，其余步骤同迁徙实验。

2 结果

2．1 抗体文库的筛选 以rhCTGF包板进行3轮循环的吸附—洗脱—扩增，其洗脱与投入克隆的比例在逐轮升高(表1)，说明CTGF特异性抗体克隆在不断地富集。

表1 ScFv抗体文库对rhCTGF的富集筛选

2．2 Phage-ELISA和阳性克隆测序 随机挑取的200个克隆，第3轮筛库洗脱克隆中有8个克隆Phage-ELISA 阳性，分别 1C5、1B9、1E2、2B4、2C10、2E9、2F5、2H1，其 A450nm值分别为 1．3、1.0、1.1、1.1、0.9、0.8、1.3、1.1，阴性对照为 0.1;DNA 测序结果表明这8个克隆为同一个克隆，被命名为1C5，其序列具有单链抗体特点。

2．3 单链抗体1C5的表达、纯化 1C5的可溶性表达只存在于菌体中，用硫酸镍亲和层析柱进行纯化，在SDS-PAGE上其相对分子量约为34 kD，其最终表达产量可达5 mg/L。见插页Ⅱ图1。

2．4 ELISA检测1C5与CTGF的结合活性 与空白及阴性对照(A450nm分别为0．08和0．14)相比，1C5的A450nm为1．33，说明其能与CTGF有很好的结合。

2．5 1C5 ScFv对CTGF功能的抑制作用 经过饥饿12 h的小鼠肾小球系膜细胞在rhCTGF的诱导下可以增强迁徙性而向下室移动。下室中1C5 ScFv在3个浓度梯度下中和rhCTGF活性，与空白对照相比，10、50、100 μg/mL 依次降低至 54．3%、14．7%、13．3%，确定1C5 ScFv浓度50 μg/mL 为小鼠肾小球系膜细胞Millicell迁移实验适宜浓度。

2．6 Millicell迁移实验 将下室含rhCTGF 550 ng/mL的迁移率定为100%，而空白对照(BSA)的迁移率仅为3．5% ±0．5%。1C5 ScFv(50 μg/mL)抑制了rhCTGF对细胞的刺激作用，其迁移率降为14．7% ±2．6%，而抗 EV71的 ScFv对 rhCTGF则无抑制作用，细胞迁移率为80．1% ±5．6%，说明1C5对CTGF具有中和作用。

3 讨论

CTGF最早由Bradham等［12］用亲和色谱法在人脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的，是一种相对分子量为38 kD的富含半胱氨酸分泌性生长因子，属于即刻早期基因、高度保守的CCN多肽家族。CTGF有4个主要蛋白结构区:胰岛素样生长因子结合蛋白区、von Willebrand因子C型重复区、血小板反应蛋白1型重复区以及生长因子半胱氨酸群［13］，由多个功能单位组成。CTGF通过截断不同结构域而在体内有多种存在形式，且多种因素调节CTGF的表达［14］，因此，其发挥生物学作用的机制较为复杂。

大量研究表明，CTGF在肿瘤的生长和转移中主要通过TGF-β通路发挥作用［15］，但这并非其所有机制。CTGF的其他结构域通过与各种生长因子及细胞表面受体之间的相互作用，促进肿瘤的生长和转移。结构域Ⅰ可以结合胰岛素样生长因子Ⅰ/Ⅱ，结构域Ⅱ可以结合VEGF，结构域Ⅳ可以结合类肝素硫酸蛋白聚糖和结合素类。因此，CTGF作用于其他生长因子及细胞表面受体而影响肿瘤的发生与发展。我们前期的研究发现，高转移的肝细胞肝癌细胞系MHCC97H表达较高的CTGF［15］，其Millicell侵袭实验显示对照组细胞侵袭率为97% ±6．1%，而处理组显著下降至36% ±4．7%(空白对照侵袭能力设为100%)。通过体内、体外实验抑制CTGF的表达可以降低肝细胞肝癌的增殖，进而纯化CTGF特异性抗体做进一步研究。本研究中我们通过体外实验证实纯化出的ScFv结合CTGF的特定结构域，以抑制其促细胞迁徙能力。下一步研究将通过鉴定本株ScFv针对的结构域来确定CTGF促细胞迁徙的具体结构域。

抗体介导的靶向治疗，是肿瘤生物治疗最具潜能的治疗手段。目前，单纯依赖抗体的靶向治疗主要机制有拮抗作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒性作用(CDC);体外的Millicell迁移实验证实，纯化的ScFv具有拮抗活性，通过对ScFv全分子化可以刺激机体产生免疫应答，通过ADCC和CDC等多种机制协同效应特异性杀伤肿瘤细胞。由于肿瘤的抗体靶向治疗需要多次给药，人体对鼠源、嵌合抗体极易产生抗体，从而影响单克隆抗体治疗效果;我们筛选人源ScFv抗体文库得到全人源抗体，由其得到的全分子化抗体将很好地解决了这一问题。

本研究通过体外实验验证了制备的单链抗体可以特异性靶向CTGF，且能中和其活性，具有应用于临床治疗的潜能。但能否通过特异性抗CTGF抗体降低组织器官微环境中CTGF的表达，进而阻碍组织器官纤维化的进展和影响肿瘤的转移侵袭，还需要接下来的动物实验及临床病例对照试验来进一步研究。

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