SD大鼠骨髓基质干细胞体外诱导成骨分化实验研究

曾铁功，赵晋英，黄泽智

(邵阳医学高等专科学校，邵阳市分子生物学重点实验室，湖南邵阳422000)

伤残肢体的完美修复，一直是人类的梦想，以干细胞工程为代表的现代组织工程学无疑为人类提供了新的期望［1］。骨髓基质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，在体内外适当的诱导条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经等多种组织。BMSCs移植具有简单、实用、费用低和无免疫排斥等优点，成为目前解决大块骨缺损修复最有前景的手段之一［2］。2012年1～8月进行本实验，旨在探讨BMSCs这类种子细胞成骨分化的条件，为后期骨组织修复工程研究提供实验基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 4周龄清洁级SD大鼠8只，由南华大学实验动物中心提供。

1．1．2 主要试剂 DMEM-LG培养基(美国 Gibco公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物公司)，胰酶(北京鼎国生物公司)，BCIP/NBT碱性磷酸酶(ALP)染色试剂和MTT试剂(北京鼎国生物公司)，茜素红(天津大茂化学试剂厂)。

1．2 方法

1．2．1 BMSCs的分离及体外培养 运用全骨髓贴壁法。清洁级4周龄SD大鼠，脱颈处死;75%乙醇浸泡10 min，剥离双股骨表面组织;无菌DMEM冲洗，剪断骨两端后，大号注射器吸取DMEM液(10%FBS，100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和20 U/mL肝素)冲洗髓腔;收集骨髓于一离心管，反复吹打，180 g×5 min离心;下层细胞层经DMEM液混匀后接种于25 mL培养瓶，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养。48 h首次换液，以后3 d换液1次。待细胞密度达80%，弃培养液;用PBS轻冲3遍，加入2．5 g/L胰蛋白酶消化、传代。传代时细胞接种密度1×104/cm2，收集第3代细胞备用，随机分为实验组及对照组。

1．2．2 成骨诱导液配制 在DMEM培养液中加入地塞米松(Dex)1×10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L和Vit-C 1×10-6mol/L，诱导实验组BMSCs向成骨细胞分化。

1．2．3 细胞生长观察 在倒置显微镜下观察细胞形态，镜检拍照。

1．2．4 细胞爬片ALP染色 在6孔板上每孔滴少量培养基，无菌操作每孔放入1张预处理的盖玻片;按1×104/cm2接种第3代BMSCs，补足含10%FBS的DMEM培养液2．5 mL/孔;待贴壁2 d后，实验组换成骨诱导液继续培养，以后3 d换液1次。分别在第3、6、10天，取出玻片经预冷 PBS洗2遍，冷4%多聚甲醛固定20 min;PBS冲洗后，用BCIP/NBT试剂37℃染色30 min;水洗，脱水透明，中性树胶封片后镜检。蓝色颗粒为阳性染色，镜检拍照。对照组不加诱导液，细胞爬片染色同实验组。

1．2．5 MTT比色法绘制细胞生长曲线 哺乳动物活细胞与噻唑蓝作用后产生紫色结晶，用二甲基亚砜溶解结晶后，在波长570 nm处测定该溶液光吸收值，可间接反映活细胞增殖能力。以1×104/cm2接种细胞于96孔板，实验组每孔加入200μL诱导液，对照组加等量基础培养液。置5%CO2孵箱中培养，3 d换液1次。每天取1板，用MTT法测每孔吸光度值，共8 d。以时间为横坐标，吸光度均值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1．2．6 成骨钙化茜素红染色 6孔板上实验组与对照组连续培养13 d后，细胞爬片行茜素红染色。4%多聚甲醛固定30 min，水洗;茜素红染色30 min，脱水透明，封片后镜检。矿化结节被染成深红色。

1．2．7 统计学方法 采用SPSS11．5统计软件。数据用±s表示，计量资料组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 细胞生长增殖、形态变化 培养的大鼠原代BMSCs 24～36 h开始贴壁，48～72 h贴壁细胞呈短梭形;4～5 d时细胞集落明显，细胞主要为短梭形成纤维样细胞，部分为多边形上皮样细胞，另外混杂圆形的非贴壁细胞，经换液逐渐清除。原代细胞生长较慢，10 d后细胞汇合达80%以上。传代细胞4～6 h迅速贴壁、伸展，恢复梭形，10 h左右细胞呈均匀生长，形态较为一致，以细长梭形为主。5～6 d后融合为单层，长满瓶底，培养过程中未见明显白色结节形成。实验组在成骨诱导条件下，细胞在培养过程中向梭性、多角形转化，有的带有数个突起，排列渐变不规则。细胞生长逐渐密集融合成团，10 d左右呈复层生长，形成多层细胞;以后逐渐形成多个散在的岛状致密细胞群，呈旋涡状，中间细胞排列紧密模糊，逐渐形成白色钙化结节。插页Ⅱ图4。

2．2 细胞生长曲线 对照组BMSCs传代接种第1天后细胞数量即开始增加，第4天增加幅度最大，至第7天细胞数量最大，以后数量略有下降，未出现指数增长期。传代培养对数增殖期为2～6 d，第7天细胞生长缓慢，进入平台期。实验组经成骨诱导的BMSCs增殖速度明显落后于前者，也未出现指数增长期。见图1。

图1 细胞生长曲线

2．3 细胞爬片ALP染色 对照组阳性细胞较少，呈稀疏条索状;而实验组诱导后阳性细胞数随时间的延长明显增多，镜下见大部分细胞质内有蓝色颗粒状或片状沉淀，见封三图5。第10天，随机取10个视野计算结果显示，实验组ALP染色阳性率为88．34% ±8．65%，而对照组为28．14% ±5．38%，P ＜0．01。

2．4 成骨钙化茜素红染色情况 实验组第13天可见橘红色的钙结节，为茜素红与钙盐形成的橘红色复合物。对照组几乎无色。见封三图6。

3 讨论

本实验通过对大鼠BMSCs分离纯化、体外培养和诱导分化的研究，为BMSCs作为骨组织工程的种子细胞提供实验室依据。目前分离纯化BMSCs的方法主要有4种，即全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠法［3，4］。本实验采用全骨髓贴壁法，该法操作简便，仅通过换液和传代筛选，便可获得较多BMSCs，且早期保留了骨髓中的其他成分，可为BMSCs的生长创造了良好的环境。在本实验中，培养的原代细胞8～10 d便可贴壁生长连接成片，形态主要为短梭形成纤维样细胞。原代细胞生长较慢，传代细胞生长快，细胞形态较为一致。传代5～6 d后可融合为单层，长满瓶底。BMSCs原代和传代培养细胞生长特性，与国内外文献报道基本一致［5，6］。

部分体外培养的BMSCs能自发分化为成骨细胞，但大部分不表达或低表达ALP，分泌的钙含量也很低，要想其稳定地向成骨分化，需加以诱导［7］。本实验参考Coelho等的方法，通过加入Dex、β-甘油磷酸钠、Vit-C对BMSCs进行体外诱导［8］。实验发现，常规培养BMSCs增殖较快;经诱导后增殖速度显著下降，细胞汇合时间明显延长，进一步证明了适当浓度的Dex抑制BMSCs的增殖［9］。这也提示要想获得分化细胞的稳定增长，接种细胞的基数要有保证。本实验中诱导后细胞大多向梭性、多角形转化，排列渐变不规则，细胞生长逐渐密集;10 d左右呈复层生长，以后逐渐形成多个散在的岛状致密细胞群，中间细胞排列紧密模糊，形成白色钙化结节。其原因可能为诱导液中Dex促进胞外胶原合成［10］;β-甘油磷酸钠可为BMSCs分化和增殖提供磷原子，促进生理性钙盐沉积;Vit-C也促进胶原合成，增加钙盐沉积等［11］。但本实验中钙结节形成时间与文献报道有差异［8］，这可能与细胞接种密度及3种诱导剂浓度差异有关。

在细胞培养中，ALP是成骨细胞分化的早期指标，是成骨细胞标志酶之一［12］;而骨矿化结节可作为成骨细胞分化的中期指标，被认为在维持正常骨钙化率和抑制软骨钙化中起作用［11］。因此，本实验采用这两项基本指标，考察分化细胞的成骨特性。在实验时发现，常规培养BMSCs仅有少量ALP阳性细胞，培养10 d时仅占28．14% ±5．38%，茜素红染色未发现钙化结节;而诱导的BMSCs，ALP阳性细胞随时间的延长明显增多，10 d阳性率达88．34% ±8．65%，在13 d时有显著密集的钙化结节。这表明Dex、β-甘油磷酸钠、Vit-C体外诱导BMSCs向成骨细胞分化良好，并已获得成熟成骨细胞的表型特征。

综上所述，本实验所采用的体外分离培养法，经Dex、β-甘油磷酸钠、Vit-C 联合诱导后，BMSCs能稳定地向具有成骨细胞特征的细胞分化，并能体外成骨，可作为成骨细胞的一种来源，但在真正应用于临床之前还有许多亟待解决的问题［13，14］，仍需进一步通过动物体内实验来证实它的稳定性和安全性。

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