外源性硫化氢对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响

唐彩霞，张树友，何英新，李 兴，周寿红

(1南华大学附属南华医院，湖南衡阳421002;2南华大学医学院)

子宫肌瘤是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，在育龄妇女中发病率高达20% ～30%［1］。目前，研究认为它是一种雌激素依赖性肿瘤［2］。硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后被发现的第3种气体信号分子，广泛分布于心血管、内脏和神经系统等［3］。研究显示，内源性或外源性H2S在多种肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，能调节肿瘤细胞的增殖与凋亡［4］。而H2S是否影响子宫肌瘤增殖和凋亡，是否参与了子宫肌瘤的发生、发展值得关注。因此，本研究应用硫氢化钠(NaHS)作为H2S供体处理人子宫肌瘤细胞，探讨了外源性H2S对人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其机制，为子宫肌瘤的治疗探索一条新的途径。

1 材料与方法

1．1 材料 NaHS、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶和四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，美国);DMEM培养基(Invitrogen公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青，中国);Hot Star Taq Master Mix试剂盒和MMLV第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen，美国)。兔抗人p53和Bcl-2单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗(Santa Cruz，美国)，PCR 引物(上海生工，中国)。CO2细胞培养箱和流式细胞测定仪(Becton-Dickinson，美国)，Bio-Rad550型酶联免疫检测仪(Bio-Rad，美国)，电子天平(Satorius，日本)，低温高速离心机(Ependorff，美国)。ABI7500型荧光定量PCR仪及分析软件(ABI公司，美国);垂直电泳仪与转膜系统(BioRad，美国);GOS7500型凝胶成像分析系统(UVP，美国)。

1．2 方法

1．2．1 细胞的制备与培养 在无菌条件下，将手术切除的新鲜肌瘤组织用含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的PBS液冲洗3遍，剪碎至体积＜1 mm3。剪碎的肌瘤组织用含Ⅰ型胶原酶(800 U/mL)的DMEM培养液于37℃消化6 h，每隔1 h吹打1次。消化结束后，1 500 r/min离心10 min收集细胞。台盼蓝染色，观察细胞活性并进行细胞记数。用培养液调整细胞浓度至5×105/mL，接种于24孔培养板。用含10%胎牛血清的培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞经免疫组化鉴定为子宫肌瘤细胞。根据细胞生长状态每2～3 d传代1次。取生长状态稳定，呈对数生长的细胞用于实验。

1．2．2 实验分组 取对数生长期的细胞，随机分为为对照组和 10－5、10－4、10－3mol/L 的 NaHS 分别处理12、24、48 h 的观察组。

1．2．3 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞增殖影响的观察 采用MTT法。对数生长期的人子宫肌瘤细胞制成细胞悬液，以1×104/孔接种于96孔培养板。观察组分别加入终浓度分别为 10－5、10－4、10－3mol/L的NaHS，每组设3个重复孔。培养12、24、48 h后，加入10μL MTT(5 mg/mL);继续培养4 h后弃培养液，加入DMSO 0．1 mL。结晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶联免疫检测仪上测定570 nm和630 nm双波长的吸光度(A)值。增殖抑制率=(对照组A值－观察组A值/对照组A值)×100%。

1．2．4 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞凋亡率影响的观察 采用流式细胞仪检测。对数生长期的子宫肌瘤细胞，以1×104/孔接种于96孔培养板。培养24 h，细胞贴壁后，观察组分别加入终浓度为10－5、10－4、10－3mol/L 的 NaHS，每组设 3 个重复孔。分别培养12、24和48 h后，收集细胞，用PBS缓冲液清洗2次，1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5μL Annexin V，再加入5μL的PI，混匀。室温下、避光、反应15 min后，上机检测。Annexin V/PI染色阳性细胞数与总细胞数的百分比为细胞凋亡率。

1．2．5 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞中 p53和Bcl-2 mRNA表达影响的观察 采用实时定量PCR法。取对数生长期的原代培养人子宫肌瘤细胞，分别加入 10－5、10－4、10－3mol/L 的 NaHS 培养 24 h后，或者10－4mol/L 的 NaHS分别培养12、24、48 h后，收集细胞。经胰蛋白酶消化后，吹打收集细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清。用Trizol提取各组细胞的总RNA。以提取的总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA第一链。选取cDNA样品10倍梯度稀释后，分别进行实时定量PCR反应，反应总体系为30μL，包含 dNTP Mix(2×)8μL，cDNA 4 μL，上下游引物各1μL，用无菌去离子水补足30 μL。PCR扩增参数为:95℃10 min激活Taq酶，94℃ 55 s，72℃ 60 s，40个循环。p53引物:上游:5'-GTTTCCGTCTGGGCTTCTTG-3'，下游:5'-CACAACCTCCGTCATGTGCT-3'。Bcl-2 引 物:上 游:5'-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3'，下游:5'-CCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3'。β-actin引物:上游:5'-ACACTGTGGCCCATCTACGAGG-3'，下游:5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3'。采用 2－△△CT法处理荧光定量PCR数据，以对照组为100%对目的基因的mRNA表达进行分析。

1．2．6 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞中 p53和Bcl-2蛋白表达影响的观察 取对数生长期的原代培养人子宫肌瘤细胞，分别加入 10－5、10－4和 10－3mol/L的 NaHS培养 24 h后，或者 10－4mol/L的NaHS分别培养12、24和48 h后，收集细胞。加入蛋白裂解液500μL裂解细胞40 min，20 000 r/min离心20 min，收集上清，提取细胞的总蛋白。BAC法进行蛋白定量。100μL蛋白质样本加入到2×SDS凝胶缓冲液中，煮沸使蛋白质充分变性。6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h分离蛋白质，电压为80 mV。将分离的蛋白质转膜至聚偏氟乙稀膜上，丽春红染色观察转移效果。10%脱脂牛奶室温下封闭2 h，加入兔抗人 Bcl-2(1∶150)、p53(1∶200)和β-actin(1∶150)抗体，4℃下过夜。TBST缓冲液洗膜3次，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，4℃下孵育4 h，TBST缓冲液洗膜3次。蛋白质印迹荧光检测试剂盒显示于X线片，显影和定影后，凝胶图像分析系统对胶片进行扫描和半定量分析。

1．2．7 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞增殖的影响随着外源性H2S浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐增加，呈现浓度和剂量依赖性(P均 ＜0．05)。见表 1。

2．2 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞凋亡的影响观察组随着外源性H2S浓度的增加和作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加，呈现浓度和剂量依赖性(P 均 ＜0．05)。见表2。

表1 外源性H 2S对人子宫肌瘤细胞增殖的影响±s)

表1 外源性H 2S对人子宫肌瘤细胞增殖的影响±s)

NaHS(mol/L)细胞增殖抑制率(%)F P 10－5 12 h 24 h 48 h＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 6．83 ±0．75 9．32 ±1．27 13．34 ±2．01 7．15 ＜0．05 10 －4 17．22 ±2．89 22．71 ±3．46 31．42 ±4．15 8．64 ＜0．05 10 －3 26．58 ±3．17 29．28 ±3．04 38．33 ±3．47 9．52 ＜0．05 F 8．61 8．27 9．14 P

表2 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞凋亡的影响(±s)

表2 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞凋亡的影响(±s)

组别细胞凋亡率(%)0 h 12 h 24 h 48 h F P对照组 3．16 ±0．53 4．54 ±0．65 6．31 ±0．84 8．27 ±1．04 3．42 ＞0．05观察组10 －5 mol/L 3．04 ±0．24 10．27 ±1．24 18．74 ±2．45 25．61 ±3．14 6．36 ＜0．05 10 －4 mol/L 4．12 ±30．38 19．62 ±2．73 35．15 ±5．02 51．37 ±6．45 7．84 ＜0．01 10 －3 mol/L 3．75 ±0．49 27．53 ±2．51 44．63 ±4．69 58．44 ±6．84 8．19 ＜0．01 F 0．97 4．53 7．44 8．32 P ＞0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．01

2．3 外源性H2S对人子宫肌瘤细胞中p53和Bcl-2表达的影响 与对照组(相对表达为1)比较，NaHS(10－5、10－4、10－3mol/L)处理 24 h 后 p53 mRNA 表达显著增加(相对表达分别是 1．34 ±0．16、1．87 ±0．20和 2．69 ±0．28)，呈浓度依赖性增加(P 均 ＜0．05)。10－4mol/L 的 NaHS 培养 12、24、48 h 后，人子宫肌瘤细胞中p53 mRNA的相对表达分别是1．37±0．15、1．89 ±0．18 和2．73 ±0．29，呈时间依赖性增加(P均＜0．05)。与对照组(相对表达为1)比较，NaHS(10－5、10－4、10－3mol/L)处理24 h 后 Bcl-2 mRNA 表达显著降低(相对表达分别是0．79 ±0．09、0．51±0．06和0．16 ±0．02)，呈浓度依赖性降低(P 均 ＜0．05)。10－4mol/L 的 NaHS 培养 12、24、48 h 后，人子宫肌瘤细胞中Bcl-2 mRNA的相对表达分别是0．81±0．09、0．49 ±0．07 和 0．17 ±0．03，呈时间依赖性降低(P均＜0．05)。蛋白表达的结果见插页Ⅱ图3，观察组随着药物浓度的增加和作用时间的延长，p53蛋白的表达逐渐增加(P均＜0．05)，而Bcl-2蛋白的表达逐渐降低(P均＜0．05)。

3 讨论

子宫肌瘤是女性生殖器系统中最常见的良性肿瘤之一，临床表现主要为子宫增大、阴道不规则出血、月经异常、腹痛、不孕、流产、邻近器官压迫症状等。有2/3的子宫肌瘤患者可没有明显症状，往往是通过体检偶尔发现［5］。子宫肌瘤的发病机理以及发生、发展的分子生物学基础，尚不完全清楚。目前研究认为，子宫肌瘤是一种激素依赖性疾病，雌孕激素在子宫肌瘤的发生、发展中发挥重要作用，雌孕激素有诱发并促进子宫肌瘤生长的作用。雌孕激素受体的高表达是公认的子宫肌瘤细胞生物学特性之一［6］。子宫肌瘤是导致子宫切除的主要原因之一，严重危害了妇女的身心健康。因此，寻找新的治疗途径具有十分重要的意义。

研究表明，H2S和NO、CO一样，符合作为细胞内及细胞间信使物质的标准，被认为是第3种气体信号分子。H2S可以在哺乳动物细胞中经胱硫醚β合成酶、胱硫醚1裂解酶和半胱氨酸转移酶等催化产生［7］。H2S在体内存在有两种形式，即气体H2S和NaHS形式。NaHS在体内液体环境中可离解为钠离子和硫氢根离子，而硫氢根离子与体内的氢离子结合生成H2S，H2S和NaHS之间形成一种动态平衡［8］。NaHS比H2S更容易保证溶液中H2S浓度的稳定和准确度，因此常使用NaHS作为外源性H2S的供体。H2S的生理和病理生理作用目前尚未完全阐明，它不仅在生理条件下参与了许多机体生理功能的调节，而且还参与许多疾病的病理过程［9，10］。

子宫肌瘤的发生、发展与子宫肌瘤细胞的增殖、分化和凋亡的异常密切相关，对细胞增殖和凋亡进行干预是目前肿瘤治疗的一种新策略。H2S可以对多种细胞的增殖和凋亡有调节作用，一方面可以通过活化细胞周期促进细胞增殖，另一方面可以启动细胞凋亡机制诱导细胞死亡，其效应与H2S的剂量和细胞类型有关［11，12］。本研究结果显示，NaHS以浓度依赖的方式抑制人子宫肌瘤细胞的增殖促进其细胞凋亡。p53和Bcl-2蛋白是重要的凋亡调节蛋白，p53是重要的肿瘤抑制基因，能与DNA特异结合，控制着细胞周期的启动［13，14］。Bcl-2 是细胞凋亡线粒体途径中重要的调节因子，Bcl-2可通过多种途径抑制凋亡的发生，是重要的抗凋亡基因［15］。我们的研究结果显示，NaHS以浓度依赖的方式上调了人子宫肌瘤细胞中p53 mRNA和蛋白表达水平，而下调了Bcl-2 mRNA和蛋白的表达。

总之，我们的研究阐明，外源性H2S可抑制人子宫肌瘤细胞增殖、促进其凋亡，该作用可能与H2S上调p53的表达而下调Bcl-2的表达有关。

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