大鼠L6前根切断再吻合后尿道外括约肌运动终板的形态变化

王志新，王明鹤，高晓群＊

（1.郑州大学基础医学院 人体解剖学教研室 河南 郑州 450052，2.郑州市卫校 人体解剖学教研室 河南 郑州 450052）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是中枢神经损伤中最常见的疾病［1］，损伤后引起的神经源性膀胱功能障碍一直是未能很好解决的临床难题之一，探索解决这一问题的途径，有利于提高截瘫患者的生活质量，降低其死亡率。神经源性膀胱理想的治疗手段是实现膀胱的可控性排尿［2］，而尿道外括约肌是实现膀胱可控性排尿的物质基础。尿道外括约肌是环绕尿道膜部的横纹肌，受阴部神经支配。在正常雄性大鼠其低级中枢位于脊髓L6～S1节段的骶副交感核，阴部神经兴奋时可使外括约肌收缩；而尿道外括约肌的松弛，则是阴部神经活动的反射性抑制所造成的。我们运用氯化金压片染色技术从形态学方面研究L6前根切断再吻合后大鼠尿道外括约肌运动终板的恢复情况，为临床治疗神经源性膀胱提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级成年雄性大鼠77只（郑州大学医学院动物实验中心提供），体质量180～200g，随机分为正常组、假手术组、手术组3组。

1.2 实验动物的处理

正常组大鼠不作任何处理。手术组用体积分数为10% 水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉，剃去背部体毛，俯卧位，消毒后取背部正中切口，依次切开皮肤、浅筋膜，向两侧钝性分离竖脊肌，牵开肌肉和皮肤，辨认L6～S1间隙的位置；用咬骨钳咬开L4～L6棘突和左侧椎板，打开硬脊膜，手术显微镜下用神经剥离子及神经拉钩仔细分离出左侧L6 前根，在L6神经出椎间孔水平分别离断其前根，用10－0无损伤针线椎管内吻合L6前根中枢端和外周端，同时把右侧的L6 截断不缝合，关闭椎管，间断缝合皮肤。术后每日肌注氨苄西林，连续15d，用外力挤压排空膀胱，3～4次／d。假手术组同手术组把两侧L6分别截断但不缝合。

1.3 氯化金压片染色法［3］

收集术后1、4、8、16周的3组大鼠，体积分数为10%的水合氯醛麻醉，取尿道外括约肌立即放入冰箱冷冻，24h后进行氯化金压片染色法：①固定：将尿道外括约肌沿肌纤维走向平均分为三部分，放入体积分数为15% 柠檬酸浸泡1～1.5h，避光存放，直到肌肉透明为止，用蒸馏水洗一遍，然后移至滤纸上吸去多余的柠檬酸。②镀金：将透明的尿道外括约肌移入体积分数为1%氯化金水溶液1.5～2.0h浸染成金黄色，取出后用滤纸吸去多余的氯化金，应严格避光。③还原：将金黄色的尿道外括约肌移入体积分数为20% 甲酸24～26h，避光保存。④尿道外括约肌从甲酸取出，用蒸馏水洗5～6次（10min／次）后放入纯甘油中过夜。⑤将尿道外括约肌从纯甘油中取出放在滤纸上，用针状物将肌肉分为3段，移置于载玻片上，滴纯甘油，加盖玻片顺肌纤维方向将其轻轻压平，注意防止神经纤维和运动终板断碎。在显微镜下观察尿道外括约肌运动终板形态学变化。

2 结果

光镜下观察，正常组肌纤维排列有序，运动终板呈椭圆或卵圆形分布于肌纤维表面，结构完整，边缘光滑；手术组、假手术组术后1周尿道外括约肌运动终板在着色、结构上与正常组无明显差别；手术组、假手术组术后4周尿道外括约肌运动终板开始出现退变，终板染色变浅，轴索终末分枝减少，部分终板边缘皱缩，中央出现空泡样淡染区；手术组、假手术组术后8周尿道外括约肌运动终板明显退变，出现大的染色空白区，终板减少甚至消失，显示模糊的轮廓；术后16周，假手术组尿道外括约肌运动终板消失，仅有少量的神经丝，而手术组尿道外括约肌运动终板增多，在着色和结构上接近正常组。见图1。

1 各组不同时间尿道外括约肌运动终板的形态学变化

3 讨论

当膀胱内尿量充盈到一定程度时（400～500mL），膀胱壁的牵张感受器受到刺激而兴奋，冲动沿盆神经传入，到达骶髓的排尿反射初级中枢；同时，冲动也到达脑干和大脑皮层的排尿反射高位中枢，并产生排尿欲。排尿反射进行时，冲动沿盆神经传出，引起逼尿肌收缩、尿道内括约肌松弛，于是尿液进入后尿道，这时尿液刺激尿道的感受器，冲动沿阴部神经再次传到脊髓排尿中枢，进一步加强其活动，使尿道外括约肌开放，于是尿液被强大的膀胱内压（可高达14.7kPa）驱出［4］，只有尿道外括约肌功能正常时，才能实现可控性排尿。在正常生理状态下，运动神经元通过运动终板与骨骼肌纤维建立联系，支配骨骼肌完成各种生理功能［5］。神经损伤后，远端轴突发生Waller变性，导致运动终板超微结构改变明显，神经再生时，运动终板超微结构恢复正常［6］。大鼠L6前根切断吻合术后，如果再生的神经纤维能到达尿道外括约肌并形成运动终板，那么我们可以看到尿道外括约肌上运动终板的形态、数量的变化从而判断运动终板的再生或恢复情况。

从实验结果可知，L6前根切断吻合术后到16周时，手术组大鼠尿道外括约肌运动终板不论是形态还是数量都接近正常组大鼠，而假手术组到16周时尿道外括约肌运动终板则完全退化，仅有少量的神经丝。由此我们推测，手术组中观察到的运动终板，可能是再生的神经纤维沿原内脏神经既往路径到达靶器官——尿道外括约肌，并与之形成的新的运动终板。

总之，L6前根切断再吻合后，大鼠尿道外括约肌运动终板在术后16周前逐渐减少，16周后运动终板逐渐增多。但再生的运动终板功能是否正常以及这种现象与吻合神经再生修复的相关性仍需进一步的实验研究。

［1］吴萍，邓娟，邓锦波.脊髓的发育与脊髓畸变及脊髓损伤［J］.河南大学学报：医学版，2012，31（2）：134－137.

［2］Vastenholt J M，Snoek G J，Buschman H P，et al.A 7－year follow－up of sacral anterior root stimulation for bladder control in patients with a spinal cord injury：quality of life and users＇experiences［J］.Spinal Cord，2003，41（7）：397－402.

［3］张赛霞，罗灼玲.氯化金压片显示运动终板方法的探索［J］.解剖学研究，2000，22（2）：153－154.

［4］Groat W C，Wickens C.Organization of the neural switching circuitry underlying reflex micturition［J］.Acta Physiol（Oxf），2013，207（1）：66－84.

［5］Batchelor P E，Wills T E，Hewa A P，et al.Stimulation of axonal sprouting by trophic factors immobilized within the wound core［J］.Brain Res，2008，53（1209）：49－56.

［6］Yampolsky P，Pacifici P G，Witzemann V.Differential muscle－driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation［J］.Eur J Neurosci，2010，31（4）：646－658.