宫颈细胞DNA定量分析、HPV-DNA检测与液基细胞学检查在宫颈癌筛查中的应用价值

赵春兰 张会辰 王建 李利

宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居女性恶性肿瘤的第二位。全世界每年约20万女性死于宫颈癌，而新发宫颈癌病例更高达 45.9 ～50 万人［1，2］，其中我国每年新发病例 13.15 万，占世界新发病例的28.7%［3］，约95%的宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有关［4，5］。近些年，液基细胞学(TCT)检查逐步替代了传统的宫颈涂片，TBS诊断法使细胞学与组织学的诊断术语得到了较好的统一，但细胞病理学诊断方法作为一种筛查手段，对宫颈癌前病变的发展趋势无法进行预测评估。有学者建议把HPV-DNA检测及宫颈细胞DNA定量分析等手段应用于宫颈病变的早期诊断［5］。本研究通过比较分析TCT、HPV-DNA和ICM-DNA定量分析3种筛查方法在宫颈癌及癌前病变筛查中的应用价值，旨在为宫颈癌的早期发现、早期诊断及合理治疗提供一些理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年9月至2009年12月于保定市妇幼保健院行宫颈脱落细胞学检查的患者3000 例，年龄17～65岁;孕次0～7次，平均2次;产次为0～4次，平均为1次。

1.2 试剂 液基薄层细胞保存液为湖北德立森科技有限公司产品，人乳头状瘤病毒(HPV)核酸扩增分型检测试剂盒及HPV-DNA分型检测仪购自凯普生物仪器有限公司，全自动细胞DNA定量分析仪产自武汉兰丁医学高科技公司。

1.3 方法

1.3.1 TCT

1.3.1.1 标本采集与制备:临床医师用宫颈刷在3000 例受检者宫颈鳞柱状上皮交界处单向旋转6圈以上收集脱落细胞，将收集的宫颈细胞连采样刷头一并置入盛有保存液的标本瓶中，送检至我院病理科，由专门技术人员用液基薄层细胞制片仪将标本制成直径为2cm的薄层液基细胞涂片，95%乙醇固定15～30 min，行巴氏染色，标本瓶常规保存1年。

1.3.1.2 判定细胞学诊断结果阳性的标准为［6－8］:①LSIL 及以上需要进行病理活检的病例视为细胞学检查阳性结果;②鳞状上皮细胞癌和腺癌统称为癌(carcinoma)。

1.3.2 HPV-DNA 检测

1.3.2.1 标本采集与保存:对细胞学检查筛查出的ASC-US及以上病变患者行HPV-DNA检测。用杂交捕获二代检测系统专用配套采样器采集宫颈细胞标本，将标本连同采样刷头一并置入保存液。标本置于4℃冰箱保存备用，2周内上机检测。

1.3.2.2 用杂交捕获二代系统检测高危型HPV病毒:通过杂交捕获二代检测系统对所取标本行 HPV16、18、31、33、35、39、45等13种常见的HPV高危型检测。并设置阳性对照和阴性对照。

1.3.3 ICM-DNA 定量分析

1.3.3.1 标本采集与制备:将TCT筛查出的ASC-US及以上病变患者的剩余保存液再次制片，95%酒精固定后，经Feulgon染色行DNA定量分析。

1.3.3.2 DNA倍体检测:制备好的玻片行全自动细胞图像分析仪扫描:玻片置于显微镜载物台，以同一玻片上淋巴细胞核DNA含量作为正常2倍体参照细胞，保证参照细胞与分析细胞同时固定、染色，并在相同光照系统下进行测量。

1.3.4 病理组织学检查:对TCT筛查出的阳性病例同时行HPV-DNA检测和组织病理学检查。根据2004年世界卫生组织肿瘤分类及诊断标准丛书“乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学和遗传学”分册，关于宫颈上皮内病变及宫颈癌的诊断标准及相关文献［9，10］，将病理组织学检查 CINⅡ级及以上病变定为阳性。

1.4 3种检测方法的评价 采用灵敏性、特异性及准确率指标将三种检测方法与病理组织学进行比较。

1.5 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，进行多配对样本的非参数检验(Pearson 2检验)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCT与病理组织学验证结果 TCT结果:ASC-US及以上病变377例，其中阴性(ASC-US)275例，阳性102例(包括LSIL 62例、HSIL 40例、SCC 0例)。病理组织学检查结果:TCT阴性275例，其中组织学阴性(CINⅠ级及BCC病例)255例，组织学阳性(CINⅡ级及以上)20例;TCT阳性102例，其中组织学阴性52例，组织学阳性50例。TCT的敏感性为71.43%，特异性为 83.06%，准确率为 80.90%。见表 1、4。

表1 TCT与病理组织学验证 例

2.2 HPV-DNA检测与病理组织学验证结果 HPV-DNA检测阴性185例，阳性192例。病理组织学检查结果:HPV-DNA阴性185例中，组织学阴性(CINⅠ级及BCC病例)182例，阳性(CINⅡ级及以上)3例;HPV-DNA阳性192例，其中组织学阴性125例，阳性67例。HPV-DNA检测的敏感性为95.71%，特异性为59.28%，准确率为66.05%。见表2、4。

表2 HPV-DNA检测与病理组织学验证 例

2.3 CM-DNA检测与病理组织学验证结果 ICM-DNA检测阴性287例，阳性90例。病理组织学检查结果:ICM-DNA检测阴性组287例，其中组织学阴性270例，阳性17例;ICM-DNA检测阳性组90例，其中组织学阴性37例，阳性53例。ICM-DNA检测的敏感性为 75.71%，特异性为 87.95%，准确率为85.68%。见表 3、4。

表3 ICM-DNA检测结果与病理组织学验证 例

2.4 3种检测方法相比较 HPV-DNA检测的敏感性高于TCT和ICM-DNA检测，而TCT特异性高于其他两项检查(P＜0.05)，在3种检测方法中ICM-DNA检测的准确率最高(P＜0.05)。见表4。

表4 TCT、HPV-DNA检测、ICM-DNA检测的比较 %

3 讨论

宫颈癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，严重危害广大女性的生命健康，筛查宫颈癌成为目前研究的热点［11］。

细胞学检查是1928年由Papanicolaou提出，运用宫颈脱落细胞刮片以筛查宫颈癌的方法［12，13］。宫颈癌的病因学研究发现，目前可以分离鉴定出的HPV有100多种，其中与宫颈病变有关的有30余种，根据其致病性分为高危型、中危险型和低危型三种，高危型HPV是宫颈癌及癌前病变的主要原因，低危型主要引起生殖道的良行病变，中危型多导致CIN。而生殖道HPV感染在有性生活的人群中普遍存在，在每个女性一生中都有感染的可能性，但60% ～70%的人仅仅是HPV阳性而没有宫颈病变，宫颈癌变的发生还与其他因素有关，如感染持续的时间、身体状况等。由于HPV感染早于形态学改变，检测HPV具有早期预警和跟踪检测意义。

宫颈癌的发生是一个多因素、多途径、多步骤的过程，涉及到癌基因的激活与抑癌基因的失活，染色体数量和结构发生改变，从而导致非整倍体的产生，而非整倍体又是宫颈病变进展中的一个显著性标志［14］。因此，可以通过检测细胞内DNA含量的变化进行肿瘤细胞及非肿瘤细胞的鉴别诊断。

3.1 液基细胞学对宫颈癌及癌前病变筛查的价值 TCT通过液基薄层细胞学技术，去除了玻片上的粘液、血液和大量的炎细胞，可以更清晰的观察细胞形态和结构的改变，且避免了刮板上大量细胞的丢失［15］，与巴氏刮片相比细胞学筛查的准确度和敏感度有了较大的提高。钱德英［16］认为TCT虽然是宫颈癌前病变筛查的一大革命，但是判读涂片过程中易受到人为因素的影响，阴性率较高，易漏检宫颈癌及癌前病变。在本实验中TCT的敏感性和准确率均较其他两者低，特异性高于HPVDNA检测但是低于ICM-DNA检测。TCT操作简单，是一种经济便捷的宫颈癌及癌前病变的筛查方法，且液基细胞学制片方法是进行ICM-DNA检测的基本步骤，便于进行图像的扫描。此外，液基细胞学与检测高危型HPV联合应用除可提高筛查的敏感性［17］。

3.2 HPV-DNA检测对宫颈癌及癌前病变筛查的价值

3.2.1 HPV-DNA检测的常用方法:HPV感染与宫颈癌的关系是目前研究的热点，其检测主要依赖于核酸探针杂交技术。目前用于检测HPV-DNA主要有3种核酸杂交方法，即直接核酸探针法、杂交信号放大法和靶 DNA扩增法［18，19］。

3.2.2 HPV-DNA检测对宫颈癌及癌前病变筛查的价值:常规细胞学诊断HPV感染依赖于镜下细胞的形态学改变，即出现特征性的挖空细胞为诊断依据，易出现假阴性或假阳性结果［20］。杂交捕获法(HC2)是当前较为先进的检测方法。在本研究中，HPV-DNA检测的敏感性高但特异性低，准确率高于液基细胞学检查而低于ICM-DNA检测。国内有研究认为，HPVDNA检测在对宫颈病变筛查中的敏感性为60% ～70%，特异性为80% ～90%［21］，本实验结果与其存在一定的差异，考虑有以下几种原因:①高危型HPV的检出说明患者感染了HPV，但是有高危型HPV感染不一定引起细胞形态的异常改变，是否发展为宫颈癌及癌前病变与感染持续的时间、患者免疫状态等因素有关，因此患者病理组织学检查可能未检出阳性病变。②本实验中，考虑到CINⅠ级患者的临床处理与CINⅡ、CINⅢ患者不同，甚至可以不做临床处理，将CINⅠ级病例定为阴性结果，造成实验中假阴性比例减少，敏感性增高。若按CINⅠ级为阳性结果则敏感性为73.16%，则与上述研究结果相近。

本研究显示，HPV阳性病例192例，病理组织学结果只有70例在CINⅡ以上病变，其余125例中53例为BCC，72例为CINⅠ级，除了与感染持续的时间、患者免疫状态等因素有关以外，还应考虑到宫颈活检取材是否准确及医生诊断的主观性等人为因素。对于假阴性病例，不排除有其他原因导致宫颈癌前病变及宫颈癌的因素，有报导约5%的宫颈癌及癌前病变为非高危型HPV引起。

HPV检测具有早期预警和跟踪检测意义，尤其当宫颈细胞学检查(TCT)提示非典型细胞(ASCUS)时，不能确定是炎症还是有癌前病变的情况存在，就要依据HPV检测结果来决定行阴道镜检查或随诊观察。

3.3 ICM-DNA检测对宫颈癌及癌前病变筛查的价值

3.3.1 ICM-DNA检测的原理及优点:ICM是以Lamber-Beer定律为基础，结合细胞、组织和显微成像仪器的特点，测定细胞学、组织学样品的成像细胞图像的光度，以评估其化学成分的含量［22］。ICM-DNA检测能够客观、精确的测定细胞核的DNA倍体值，获得了肿瘤生物学特征信息［23，24］，为细胞形态学检查提供了有价值的补充，自动化的分析过程也很大程度上减少了阅片者主观因素的影响。

3.3.2 ICM-DNA检测对宫颈癌及癌前病变筛查的价值:染色体重组、片段的丢失或增多及染色体数目的改变，可引起基因的非整倍体扩增，导致肿瘤的发生。DNA非整倍体的出现是染色体异常的标志。本研究采用全自动细胞图像分析仪对液基细胞学检查筛查出的ASCUS及以上的病变共计377例患者行宫颈细胞DNA倍体测定，检测出大于5c细胞标本90例，其特异性为87.95%，准确率为85.68%，高于液基细胞学和HPVDNA检测，敏感性却低于HPV检测。ICM-DNA检测假阴性病例和假阳性病例分别为17例和37例，分析有以下因素造成:①良性非整倍体细胞:研究发现HPV病毒、HIV病毒感染可引起＞5c的非整倍体细胞。另外，放射治疗、激素治疗和维生素B12缺乏及激素水平紊乱均可导致细胞非整倍体扩增，但与肿瘤性非整倍体细胞不同的是当这些影响因素去除后，细胞可恢复正常整倍体。这些因素往往只引起散在的＞5c细胞，而不会形成非整倍体细胞峰。因此，当发现有非整倍体细胞，排除这些因素后，就能做出正确的诊断。②DNA-ICM硬件和软件系统问题:细胞图像分析DNA倍体测定是一种较新的DNA定量细胞研究，重叠细胞或成团细胞的分割在该系统中尚存在缺陷，仪器往往将这类细胞归为垃圾而不予扫描，从而引起误诊。不过宫颈鳞状细胞成团的机会少，液基薄层制片中细胞分布均匀而分散，此情况较少见。③检测人员水平:检测出有DNA倍体＞5c及以上倍体值细胞的玻片均要求专门细胞技术人员在显微镜下对这些细胞进行核实，以排除系统问题导致假阴性和假阳性情况。染色过程中操作不当，细胞退变严重，DNA分子结合了较多染色剂，出现假阳性结果。酸化不全，化学键没有全部打开，DNA分子染色差，出现假阴性结果。

3.4 三种筛查方法的评价 有效的筛查手段可以降低宫颈癌的发病率，研究表明，每年或每两年1次宫颈癌筛查可以使宫颈癌的发病率和病死率明显下降［25－27］。在本实验中三种方法相比，宫颈液基细胞学检查简单易行，无创伤且价格较低，易于被患者接受，但敏感性和准确率均较低，受阅片者主观影响大;宫颈细胞DNA定量分析能提供形态学之外的肿瘤生物学信息，特异性和准确率均高于其他两项检测，并且全自动图像分析系统分析过程有效降低了人为因素的影响，其结果客观准确，弥补了细胞病理学诊断的不足，适用于大规模的宫颈癌及癌前病变筛查工作。HPV-DNA检测是直接针对病因的检测，敏感性高，能够将存在潜在发病风险的妇女筛选出来，进行针对性的治疗

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