人类YB-1蛋白表达对肺腺癌术后患者预后及复发的影响

王力捷李锦绣谭庆伟王金赵磊刘晶关宏伟河野公俊顾春东

1.大连医科大学附属第一医院肺癌诊疗基地，辽宁 大连116011；

2.大连医科大学附属第一医院病理科，辽宁 大连116011；

3.日本产业医科大学分子生物学教研室，北九州市807-8555，日本

人类YB-1蛋白表达对肺腺癌术后患者预后及复发的影响

王力捷1李锦绣2谭庆伟1王金1赵磊1刘晶2关宏伟2河野公俊3顾春东1

1.大连医科大学附属第一医院肺癌诊疗基地，辽宁 大连116011；

2.大连医科大学附属第一医院病理科，辽宁 大连116011；

3.日本产业医科大学分子生物学教研室，北九州市807-8555，日本

背景与目的：人类Y盒结合蛋白，即YB-1蛋白是多功能蛋白之一，在转录与翻译两个水平调控基因表达，可作为预测人类恶性肿瘤多药耐药及判断预后的生物标记物。本文通过检测肺腺癌患者YB-1蛋白表达水平，评估YB-1蛋白在肺腺癌术后患者中的表达和对预后及复发的影响。方法：共收入174例接受肺腺癌切除术患者。其中99例男性，75例女性，平均年龄65.0岁(32～85岁)。采用S-P法进行免疫组织化学染色(抗YB-1多克隆抗体)。利用χ2检验进行统计学分析，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验比较曲线间差异，Cox比例危险模型进行单因素及多因素分析。结果：在174例肺腺癌患者中，92例(52.9%)YB-1蛋白细胞质表达阳性。YB-1蛋白表达阳性组肿瘤细胞的分化较差(P=0.003)，病理分期较晚(P＜0.001)，淋巴结转移较显著(P=0.005)，肿瘤复发较早(P＜0.001)。单因素及多因素分析表明，YB-1蛋白表达阳性组预后明显较YB-1蛋白表达阴性组差(总体生存风险分别为P＜0.001和P=0.035)。此外，在对其中102例Ⅰ期肺腺癌患者各临床病理因子的多因素分析提示，YB-1蛋白表达阳性是预测患者预后不良及肿瘤早期复发的独立危险因子(分别为P=0.048，HR=2.370和P=0.057，HR=2.242)。结论：YB-1蛋白表达水平可作为预测肺腺癌术后患者(尤其是Ⅰ期肺腺癌患者)预后及复发的指标。

人类Y盒结合蛋白；肺腺癌；预后；复发

人类Y盒结合蛋白(即YB-1蛋白)为DNA结合蛋白家族成员之一，含有高度保守的冷休克结构域(cold shock domain，CSD)，是一类特异性结合目的基因启动子Y盒序列的重要核转录因子［1］。人类的许多基因在调控区域包含有Y盒，如增生性细胞核抗原(PCNA)、表皮生长因子受体(EGFR)、DNA拓扑异构酶Ⅱ、多药耐药相关基因1(MDR1)、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白 B1等［2-3］。YB-1蛋白在细胞增殖生长、DNA修复、药物耐药、细胞周期调节及肿瘤形成等方面发挥至关重要的作用。

最近的研究表明，YB-1蛋白在肺癌中与肿瘤的发生、增殖、化疗耐药及预后相关［4］。但在肺腺癌中，YB-1蛋白的表达水平与肺腺癌患者预后及复发的关系还鲜见报道。本文为一回顾性分析，通过免疫组织化学染色方法检测肺腺癌患者YB-1蛋白的表达水平，探讨YB-1蛋白表达与肿瘤复发及患者预后的关系。

1 材料和方法

1.1 患者情况、临床特征及随访

174例肿瘤标本均来自大连医科大学附属第一医院胸外科2002年3月—2005年5月接受完全外科手术切除治疗的原发性肺腺癌患者，其中Ⅰ期肺腺癌患者102例。所有患者术前均未接受放疗或化疗。

术后第1年所有患者每个月进行1次常规随访检查，之后每隔2～4个月进行1次。评估指标包括体格检查、胸部X线、血液生化分析及肿瘤标记物测定。术后3年内，每6个月进行1次胸腹CT、脑部磁共振及骨核素扫描，期间如果发现任何肿瘤复发相关症状与体征，即对患者进行相关的检查。

174例患者中，男性99例，女性75例，平均年龄65.0岁(32～85岁)。根据2009年肺癌分期系统修订本进行肿瘤分期［5］。分期结果如下：75例为Ⅰa期，27例为Ⅰb期，12例为Ⅱa期，5例为Ⅱb期，32例为Ⅲa期，13例为Ⅲb期，10例为Ⅳ期。所有患者术后均进行常规随访，中位随访时间为1 322.5 d。随访期间96例无肿瘤复发存活，6例肿瘤复发存活，6例肿瘤复发但死于其他疾病，54例死于肿瘤复发，12例死因不明。

1.2 抗体

抗YB-1多克隆抗体［6］(由日本产业医科大学分子生物学教授河野公俊惠赠)可特异性结合YB-1蛋白C端结构域的15个氨基酸残基(299～313氨基酸残基)。抗YB-1抗体经含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶3 000稀释用于免疫染色，具体操作按试剂盒操作说明进行。

1.3 免疫组织化学染色

所有肿瘤样本均来自肺腺癌原发病灶，经过4%甲醛溶液固定，石蜡包埋处理，4 μm连续切片，伊红染色作病变定位。本实验免疫组织化学染色采用链菌素亲生物素-过氧化物酶法(S-P法)。简要过程如下：样本切片浸入枸橼酸缓冲液(0.01 mol/L 枸橼酸，pH为6.0)，在微波炉中加热至100 ℃，温育5 min，重复3次，抗体回收。抗YB-1多克隆抗体温育，置于4 ℃室内过夜。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知术后YB-1蛋白表达阳性的乳腺癌样本切片作为阳性对照。第二抗体为生物素化羊抗兔IgG，二抗及辣根过氧化物酶标记链菌素亲生物素由美国Zymed公司生产的SP试剂盒提供，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4 免疫组织化学评估

2名病理医师对所有样本切片的免疫染色结果采用双盲法计数。以细胞质呈清晰棕色为YB-1蛋白表达阳性(图1)。具体评分标准如下：随机计数5个高倍镜视野的1 500个细胞。采用二级计分法，按染色细胞比例计数分成4类：0分，无；1分，1/100至1/4；2分，1/4至1/2；3分，＞1/2。按染色强度分成4类：0分，无染色；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，强染色。比例计数得分与染色强度得分之和即为总得分，0～3分定义为肿瘤YB-1表达阴性，4～6分定义为肿瘤YB-1表达阳性。

1.5 统计学处理

实验所得数据及结果均采用χ2检验进行统计学分析。采用Kaplan-Meier方法进行生存曲线描绘。生存曲线差异性应用log-rank试验进行评估。COX比例危险模型用于单因素及多因素对预后生存的影响分析。所有实验数据均采用SPSS 11.5统计软件进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

图 1 肺腺癌组织YB-1蛋白表达Fig. 1 YB-1 expression in lung adenocarcinoma

2 结 果

2.1 YB-1蛋白在人肺腺癌中的表达

免疫组织化学检测显示，174例肿瘤样本中，92(52.9%)例样本细胞质YB-1蛋白表达阳性，82(47.1%)例样本胞质YB-1蛋白表达阴性，所有YB-1蛋白染色都位于细胞质(图1)。YB-1蛋白表达水平与患者各临床病理因子的关系见表1。YB-1蛋白表达水平与病理分级(P＜0.001)、T分期(P＜0.001)、淋巴结转移N分期(P=0.005)、肿瘤复发的相关性差异均有统计学意义。

102例Ⅰ期的肺腺癌样本中，YB-1蛋白表达与各临床病理因子比较结果见表2，YB-1蛋白表达水平与组织学分化程度(P=0.018)、肿瘤复发(P=0.008)及病理学Ⅰa、Ⅰb分期(P=0.026)的相关性差异均有统计学意义。

2.2 YB-1蛋白表达水平对患者生存与肿瘤复发的影响

本研究初步评估了YB-1蛋白表达水平对患者总体生存率的影响。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，YB-1蛋白表达阳性患者5年生存率明显低于YB-1蛋白表达阴性患者(38.9% vs 74.4%，P＜0.001，图2)。单因素分析表明，YB-1蛋白表达为影响患者生存的独立因子(表3)。多因素分析发现，YB-1蛋白表达阳性者死亡风险较高(HR=1.873，P=0.035)。此外，在对其中102例Ⅰ期肺腺癌患者各临床病理因子的多因素分析提示，YB-1蛋白表达阳性是导致患者预后不良及肿瘤早期复发的独立危险因子(P=0.048，HR=2.370和P=0.057，HR=2.242，表4)。

表 1 YB-1蛋白表达水平与174例肺腺癌患者临床病理因子的关系Tab. 1 Relations between the level of YB-1 expression and clinicopathologic characteristics in 174 cases of lung adenocarcinoma

表 2 YB-1蛋白表达水平与102例Ⅰ期肺腺癌患者临床病理因子的关系Tab. 2 Relations between the level of YB-1 expression and clinicopathologic characteristics in 102 cases of stage Ⅰ lung adenocarcinoma

表 3 比例危险模型对174例肺腺癌患者总生存率的单因素及多因素分析Tab. 3 Univariate and multivariate analyses using a proportional hazard model for survival of 174 lung adenocarcinoma patients

表 4 比例危险模型对102例Ⅰ期肺腺癌患者总生存率的单因素及多因素分析Tab. 4 Univariate and multivariate analyses using a proportional hazard model for survival of 102 patients with stage Ⅰ adenocarcinoma

为了探讨YB-1蛋白表达对术后早期肿瘤复发的影响，本研究应用Kaplan-Meier法描绘了无病生存曲线。在对102例Ⅰ期肺腺癌患者进行生存曲线分析发现，YB-1蛋白表达阳性患者3年无病生存率低于YB-1蛋白表达阴性患者(63.5% vs 89.2%，P=0.006，图3)。单因素分析发现，组织学分化程度与YB-1蛋白表达明显影响Ⅰ期肺腺癌患者的无病生存率(表5)。多因素生存分析提示，YB-1蛋白表达不能独立影响患者的无病生存(P=0.057临界)，YB-1蛋白表达阳性增加了患者的死亡风险(HR=2.242)。

图 2 174例肺腺癌患者总生存率的生存曲线分析Fig. 2 Survival curves of the overall 5-year survival rates in 174 lung adenocarcinoma patients

图 3 102 例肺腺癌患者(病理Ⅰ期) 无病生存率的生存曲线分析Fig. 3 Survival curves of the disease-free 3-year survival rates in 102 stage Ⅰ lung adenocarcinoma patients

表 5 比例危险模型对102例Ⅰ期肺腺癌患者无病生存率的单因素及多因素分析Tab. 5 Univariate and multivariate analyses using a proportional hazard model for disease-free survival of 102 patients with stage Ⅰlung adenocarcinoma

3 讨 论

肺癌是当今世界危及人类健康的重要疾病。在我国，肺癌已成为恶性肿瘤死亡的首位因素，且发病率及病死率仍在继续上升。肺腺癌侵袭性较高，早期便伴有淋巴结及血液转移，患者预后较差。因此，通过评估肿瘤恶性程度从而更为精确地预测肺腺癌患者预后显得极为重要。目前，YB-1蛋白在分子生物学及基因学研究领域的不断进步，使其成为准确评估肿瘤增殖能力及患者预后的重要参考指标。Dahl等［7］报道了YB-1蛋白在乳腺癌、肺癌及骨肉瘤等恶性肿瘤中的情况。Shibahara等［8］在非小细胞肺癌中发现YB-1蛋白表达阳性的患者更易出现淋巴结转移、预后不良，YB-1蛋白表达可作为预测肺鳞状细胞癌进展的重要因子。

我们既往小样本关于YB-1蛋白在肺腺癌中表达的研究数据表明［6］，细胞质YB-1蛋白表达阳性与T分期、淋巴结转移相关，但是没有很好地解答有关预后和复发的情况。从本次大样本研究中可以看出，YB-1蛋白表达水平与肿瘤分化程度、病理分级、TNM病理分期和肿瘤复发存在显著关联。其中N0-1期YB-1蛋白表达阳性率显著低于N2-3期，说明淋巴结转移N因子在其中起了决定作用，表明YB-1蛋白表达在肺腺癌进展过程中起着重要作用。细胞质YB-1蛋白表达阳性患者肿瘤复发可能性大，预后差，为一独立危险因素。YB-1蛋白表达水平同样影响肺腺癌分化程度。YB-1蛋白表达阳性患者肿瘤细胞分化较差，阴性患者肿瘤细胞分化良好。这与Dahl等［7］报道的结果相同。总的来说，低分化肺腺癌细胞中YB-1蛋白阳性率高比高分化肺腺癌细胞恶性度更高，患者预后不佳。细胞质YB-1蛋白可作为预测肺腺癌恶性程度的重要标志物。

本研究有25例复发，其中YB-1蛋白表达阳性占16例(P=0.008)，18例在2年内出现复发。Ⅰ期肺腺癌患者3年无病生存曲线提示，YB-1蛋白表达阳性者会更早出现肿瘤复发，无病生存期明显缩短，提示YB-1蛋白表达阳性患者术后需要密切随访。

既往的研究结果表明，YB-1蛋白主要存在于细胞质中，但当受到紫外线照射或抗癌药处理后可发生核转移现象［9］。本研究中，YB-1蛋白表达阳性的细胞均为肿瘤细胞，且都表现为细胞质阳性。癌间质与周围结缔组织中均未观察到YB-1蛋白表达，表明YB-1蛋白特异性地出现于肺腺癌肿瘤组织中。Janz等［10］发现细胞质中YB-1蛋白高表达与细胞核内表达同时出现，因此推测细胞质内YB-1蛋白高表达可能促进了部分YB-1蛋白向细胞核内转移。本研究发现约20%的肿瘤细胞的细胞核周围出现了较明显的YB-1蛋白表达，经随访发现这部分患者较单纯细胞质YB-1表达的患者有更差的预后和早期复发的风险。我们推测，这部分细胞核周围细胞质表达的YB-1蛋白可能更容易进入细胞核内，激活MDR1和细胞周期相关因子等多种基因的表达，导致肿瘤早期复发及多药耐药，预后不良。

尽管Hyogotani等［11］报道YB-1蛋白核表达水平可用于评估患者预后，但Jurchott等［13］则认为，患者预后不良是由YB-1蛋白细胞质过表达导致的，因为肿瘤细胞中极少检测到YB-1蛋白细胞核表达(＜2%的肿瘤细胞)，而本研究亦未检测到其细胞核内表达。出现这种肿瘤细胞内差异表达的现象，可能是由抗YB-1多克隆抗体免疫反应方面的内在差异造成。因此，将来使用标准化抗体进行YB-1蛋白的检测，以便使YB-1蛋白能够作为可靠预后标志物被广泛应用于临床肿瘤检测。

［1］ KOHNO K, IZUMI H, UCHIUMI T, et al. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1 ［J］. Bioassays, 2003, 25: 691-698.

［2］ JURCHOTT K, BERGMANN S, STEIN U, et al. YB-1 as a cell cycle-regulated transcription factor facilitating cyclin A and cyclin B1 gene expression ［J］. J Biol Chem, 2003, 278: 27988-27996.

［3］ 栾焕玲, 孙蕾娜, 董娜, 等. 非小细胞肺癌中EGFR和K-ras基因突变与蛋白表达相关性的研究 ［J］. 中国癌症杂志, 2010, 20(7): 486-491.

［4］ GU C, OYAMA T, OSAKI T, et a1. Low expression of polypeptide GalNAc N-acetylgalactosaminyl transferase-3 in lung adenocarcinoma: impact on poor prognosis and early recurrence ［J］. Br J Cancer, 2004, 90: 436-442.

［5］ DETTERBECK F C, BOFFA D J, TANOUE L T. The new lung cancer staging system ［J］. Chest, 2009, 136: 260-271.

［6］ GU C, OYAMA T, OSAKI T, et al. Expression of Y boxbinding protein-1 correlates with DNA topoisomerase II alpha and proliferating cell nuclear antigen expression in lung cancer ［J］. Anticancer Res, 2001, 21: 2357-2362.

［7］ DAHL E, EN-NIA A,WIESMANN F, et al. Nuclear detection of Y-box protein-1 (YB-1) closely associates with progesterone receptor negativity and is a strong adverse survival factor in human breast cancer ［J］. BMC Cancer, 2009, 9: 410.

［8］ SHIBAHARA K, SUGIO K, OSAKI T, et al. Nuclear expression of the Y-Box binding protein, YB-1, as a novel marker of disease progression in non-small cell lung cancer［J］. Clin Cancer Res, 2001, 7: 3151-3155.

［9］ KUWANO M, UCHIUMI T, KOHNO K. The basic and clinical implications of ABC transporters, Y-box-binding protein-1 (YB-1) and angiogenesis-related factors in human malignancies ［J］. Cancer Sci, 2003, 94: 9-14.

［10］ JANZ M, HARBECK N, DETTMAR P, et al. Y-box factor YB-1 predicts drug resistance and patient outcome in breast cancer independent of clinically relevant tumor biologic factors HER2, UPA and PAI-1 ［J］. Int J Cancer, 2002, 97: 278-282.

［11］ HYOGOTANI A, ITO K, YOSHIDA K, et a1. Association of nuclear YB-1 localization with lung resistance-related protein and epidermal growth factor receptor expression in lung cancer［J］. Clin Lung Cancer, 2012, 13: 375-384.

［12］ JURCHOTT K, BERGMANN S, STEIN U, et a1. YB-1 as a cell cycle-regulated transcription factor facilitating cyclin A and cyclin B1 gene expression ［J］. J Biol Chem, 2003, 278: 27988-27996.

The expression of the human Y-box binding protein: impact on prognosis and recurrence in patients with resected lung adenocarcinoma

WANG Li-jie1, LI Jin-xiu2, TAN Qing-wei1, WANG Jin1, ZHAO Lei1, LIU Jing2, GUAN Hong-wei2, KOHNO Kimitoshi3, GU Chun-dong1(1.Lung Cancer Center, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University; Dalian Liaoning 116012, China; 2. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University; Dalian Liaoning 116012, China; 3.Department of Molecular Biology, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyusyu 807-8555, Japan)

GU Chun-dong E-mail: chundong2003@163.com

Background and purpose：The human Y-box binding protein, YB-1, is one of multifunctional proteins that regulates gene expression at both the transcriptional and translational levels. YB-1 has the potential to be used as a biomarker and predictor of multidrug resistance and prognosis in human cancers. This study was designed to detect YB-1 expression in lung adenocarcinoma by using immunohistochemical staining, and to evaluate the expression of YB-1 in patients with resected lung adenocarcinoma as well as its impact on their prognosis and recurrence. Methods：A total number of 174 lung adenocarcinoma patients who underwent surgical treatment were enrolled in this study. There were 99 men and 75 women with age of 65.0 years (range from 32 to 85). Immunohistochemical staining was done using by a streptavidin-biotin-peroxidase complex method (polyclonal anti-YB-1 antibody). The statisticalsignificance was evaluated using the Pearson’s χ2test. Survival curves were plotted according to the Kaplan–Meier method, and differences between the curves were analyzed by the log-rank test. The Cox proportional hazards model was applied to the univariate and multivariate survival analysis. Results：Positive expression of YB-1 was detected in the cytoplasm of tumor cells in 92 of 174 patients (52.9%) with lung adenocarcinoma. The positive expression of YB-1 was associated with poorly differentiated tumor (P=0.003), poor pathologic stage (P＜0.001), lymph node metastasis (P=0.005) and tumor recurrence (P＜0.001). The lung adenocarcinoma patients with positive YB-1 expression had a poorer prognosis than those with negative YB-1 expression, using both univariate and multivariate analyses (overall survival risk: P＜0.001 and P=0.035, respectively). In addition, multivariate analysis of the clinicopathological characteristics with stageⅠlung adenocarcinoma indicated that the positive expression of YB-1 was a significant independent factor for predicting poor prognosis and early recurrence (P=0.048, HR=2.370 and P=0.057, HR=2.242, respectively). Conclusion：The expression of YB-1 plays an important role in predicting prognosis and recurrence in patients with resected lung adenocarcinoma, particularly patients with stageⅠ diseases.

YB-1; Lung adenocarcinoma; Prognosis; Recurrence

R734.2

：A

：1007-3639(2013)02-0099-07

2012-09-10

2012-12-20）

国家自然科学基金项目(No：81173453)；大连市科技计划重大项目(No：2012E15SF141)。

顾春东 E-mail:chundong2003@163.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.004