共刺激分子B7-H3在人原发性肝癌中的表达及临床意义

河北医科大学第四医院肿瘤研究所，河北 石家庄 050011

共刺激分子B7-H3在人原发性肝癌中的表达及临床意义

王玲 曹娜娜 单保恩 曹玉 李杰 王岩 徐莹莹

河北医科大学第四医院肿瘤研究所，河北 石家庄 050011

背景与目的：B7-H3是近年来新发现的协同刺激分子B7家族成员，但目前其在人原发性肝癌中的表达及作用尚不明确。本研究旨在通过检测人肝癌组织中B7-H3分子的表达，探讨B7-H3在肝癌发生、发展中的临床意义。方法：采用免疫组织化学法、半定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测71例肝癌组织、对应癌旁组织及正常肝组织中B7-H3分子的蛋白、mRNA表达以及CD8+T淋巴细胞的浸润程度。结果：肝癌组织中B7-H3蛋白的阳性表达率为93.0%(68/71)，而B7-H3在癌旁及正常肝组织中几乎不表达。肝癌组织中B7-H3 mRNA表达水平比癌旁组织和正常肝组织显著升高(P＜0.05)。B7-H3的表达与患者AFP水平、TNM分期及肝内有无转移差异有统计学意义(P＜0.05)，与肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞浸润程度呈负相关(P＜0.05)，与患者预后呈负相关(P＜0.05)。结论：B7-H3在肝癌中高表达，和多项临床病理因素具有明显的关联。肝癌中B7-H3分子表达可能参与了抑制肝癌组织内CD8+T细胞功能，促进肝癌细胞逃避免疫监视，提示B7-H3在肝癌早期诊断、判断预后及靶向治疗中具有潜在的临床应用价值。

B7-H3；人原发性肝癌；免疫组织化学

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝细胞或肝内胆管细胞发生的恶性肿瘤，严重危害人类的生命健康。每年全球新患HCC人数为62.6万人，因该病死亡者高达59.8万人，位居全球恶性肿瘤发病率第6位，死亡原因第3位。近20年来我国肝癌的死亡率增加了41%，在恶性肿瘤致患者死亡人数中居第2位［1］。尽管近年来针对肝癌的局部治疗得到了较快的发展，但总体上尚未取得令人满意的临床疗效，特别是对晚期肝癌的治疗一直没有取得实质性进展。

随着经典途径B7-CD28/CTLA-4在肿瘤免疫中作用的广泛共识，B7家族成员不断扩大，其中B7-H3是近年来新发现的协同刺激分子B7家族成员［2］。有研究显示，B7-H3蛋白在正常人体组织中很少表达，却广泛表达于多种肿瘤组织，如胃癌、肺癌、前列腺癌、肾癌以及成神经细胞瘤等［3］。本实验通过研究B7-H3 在肝癌组织中的表达及其与各临床病理变量之间的相关性，探讨B7-H3的表达在HCC发生、发展中的作用，以期从免疫学角度为HCC的研究和治疗提供新的方法和路径。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集2008年1月2日—2009年2月12日河北医科大学第四医院住院的HCC患者71 例，均接受手术切除治疗，采集新鲜肝癌组织和癌旁肝组织标本各71例。其中男性52 例，女性19 例。年龄38～72 岁，中位年龄57岁。其中53 例是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染患者。所有患者均未行化疗及生物免疫治疗，亦未合并自身免疫性疾病及其他器官的肿瘤(如肺癌、胃癌、结肠癌等)。所有标本均有详细临床资料，组织标本均经过HE染色、读片，确认为肝细胞癌。手术标本取材时，肝癌组织均取自癌变原发灶，避开坏死、炎症区域，癌旁组织取自相应肿块旁3～5 cm肝组织。同时，收集在消化内科住院接受肝组织活检的10例正常肝组织(男性7例，女性3例，年龄25～54岁)作为对照研究。将手术标本和活检组织标本立即置于液氮罐中速冻，后转移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。所有实验研究均得到患者知情同意，并得到医院医学伦理部门的批准。

1.2 免疫组化检测

标本经4%甲醛溶液浸泡固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，切取4 μm厚切片。二甲苯脱蜡，在梯度乙醇内水化。抗原修复后，于0.3%的H2O2中浸泡20 min阻断内源性抗原。用PBS 洗3次，用10%正常的血清温育以阻断背景非特异性的染色。羊抗人B7-H3 多克隆抗体(R&D公司，1∶100 稀释，一抗)湿盒内温育过夜。经PBS冲洗后加生物素标记二抗(北京中杉公司)，37 ℃，30 min；加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃，30 min，DAB显色。苏木精复染，脱水透明封片。CD8免疫组化染色方法同上(CD8抗体购自Santa公司，1∶100稀释)。

1.3 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测

将收集的组织标本放在装有液氮的研钵中充分研磨，按照TRIzol试剂说明书逐步加入氯仿、异丙醇、乙醇等提取RNA，并测定RNA浓度、纯度和完整性。以提取的总RNA为模板，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Fermantas公司)说明书进行操作。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。B7-H3上游引物：5’-ACCATCACAGGGCAGCCTAT-3’，下游引物：5’-TCCTCAGCTCCTGCATTCTC-3’，产物片段为155 bp。GAPDH上游引物：5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游引物：GAPDH下游5’-GTAGAGGCAGGGAT GATGTTC-3’，产物片段为287 bp。PCR扩增反应步骤如下：反应体积为25 μL，94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃褪火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共35个循环。72 ℃ 5 min，4 ℃终止。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射反射仪下观察结果，并在凝胶成像仪上照相，扫描所得灰度值进行统计学分析。

1.4 结果判定

由2位病理科主任医师进行独立阅片。B7-H3染色结果评估：光镜下每张切片选中肿瘤细胞较多的5个高倍视野，每个视野计数100个细胞。以在细胞质或细胞膜上有棕黄色颗粒视为阳性细胞，结合染色强度和阳性细胞百分比评分如下：＜10%肿瘤细胞着色为阴性“-”；10%～30%肿瘤细胞着色为“+”；30%～60%肿瘤细胞着色为“++”；＞60%肿瘤细胞着色为“+++”。为了便于分析，将评分为“-”和“+”定为低表达组，“++”和“+++”定为高表达组。

CD8+T淋巴细胞浸润程度的评估：根据CD8+T淋巴细胞在肿瘤中的分布情况，划分为4个等级：0为无浸润；1为局部少量浸润；2为适度浸润；3为大量浸润。其中0和l归为低度浸润组，2和3归为高度浸润组。

1.5 统计学处理

采用SPSS 12.0软件对数据进行统计分析。B7-H3 的表达与临床病理变量之间的关系采用χ2检验及Fisher精确检验分析; B7-H3 与CD8+T细胞之间的相关性用Spearman相关性分析。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 B7-H3 在肝癌组织中的表达

免疫组化结果显示，B7-H3阳性着色主要定位在肿瘤细胞的细胞质和细胞膜(图1)。在71例HCC患者中，B7-H3阳性表达68例，阳性率为95.8%。其中16例(22.5%)肿瘤细胞显示B7-H3弱阳性表达；31例(43.7%)肿瘤细胞显示B7-H3中等强度表达；21例(29.6%)肿瘤细胞显示B7-H3强阳性表达。癌旁肝组织表达则明显偏弱。

2.2 肝组织中B7-H3 mRNA表达

肝癌组织中B7-H3 mRNA条带明显增亮，应用灰度扫描半定量分析，B7-H3 mRNA在肝癌组织、癌旁组织和正常组织中阳性表达灰度值分别为1.27±0.32、0.51±0.19和0.38±0.09。统计学分析发现，B7-H3 mRNA在肝癌组织的表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.05)和正常组织(P＜0.05)，而癌旁组织和正常组织间B7-H3 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05，图2)。

2.3 肝癌组织中B7-H3的表达水平与患者临床病理参数的相关性

肝癌组织中B7-H3阳性表达率与患者性别、年龄、HbsAg携带状态、肿瘤大小及个数、child分级、门脉癌栓等差异均无统计学意义(P＞0.05)；与患者的AFP水平、TNM分期、肝内是否有转移差异有统计学意义(P＜0.05)。随着患者的AFP水平升高，B7-H3的表达水平增加；临床TNM分期越晚，B7-H3的表达率越高。发生肝内转移患者的B7-H3的表达率高于未发生转移的患者(表1)。

2.4 肝癌组织中B7-H3的表达水平与CD8+T细胞浸润程度的相关性

经抗CD8单抗免疫组化标记，71例肝癌组织中，CD8+T淋巴细胞低度浸润39例，高度浸润32例(图3)。Spearman相关分析检验发现，肝癌组织中B7-H3的表达水平和CD8+T淋巴细胞浸润程度呈负相关(P=0.003，表2)。

图 3 肝癌组织中浸润的CD8+T细胞Fig. 3 Representative immunohistochemical staining of tumorinfiltrating CD8+T cells (DAB, ×100)

2.5 B7-H3在肝癌中的表达和患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析结果显示，B7-H3阳性表达的患者，其预后与B7-H3阴性表达的患者差异有统计学意义(P＜0.05)，B7-H3高表达患者总体生存率明显低于低表达患者(P＜0.05，图4)。

表 1 肝癌组织中B7-H3的表达水平与临床病理参数的关系Fig. 1 Correlation of B7-H3 and clinicopathological data in HCC

表 2 肝癌组织中B7-H3与CD8+T细胞浸润程度的相关性Fig. 2 Correlation of B7-H3 and the infiltration of CD8+T in HCC

图 4 肝癌组织中B7-H3的表达水平和患者预后的关系Fig. 4 Expression of B7-H3 in HCC and its relation with postoperative prognosis

3 讨 论

B7-H3分子由Chapoval等［4］从DC的cDNA库中克隆出 B7家族的新成员，人B7-H3基因定位于15q24，属于免疫球蛋白的Ⅰ型跨膜蛋白。B7-H3以转录形式高表达于心脏、肝脏、胎盘、前列腺、睾丸、子宫、胰腺、小肠、结肠和淋巴器官中，而其蛋白表达谱却十分局限。目前研究资料显示，B7-H3蛋白在诸多肿瘤组织中高表达，包括胃癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、成神经细胞瘤等，并与肿瘤生物学特性、患者的预后转归有很大关系［5］。最初研究显示，B7-H3可协同抗CD3单抗刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖，并上调T细胞IFN-γ、IL-10和TNF-α的表达和分泌，同时经由IFN-γ促进CTL的活化，从而发挥抗肿瘤作用［4］。但随后的研究发现，B7-H3亦可抑制T细胞增殖，同时下调IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等细胞因子的分泌［6］。

本研究发现，在人肝癌组织标本中B7-H3蛋白及mRNA水平在肿瘤细胞上均异常高表达。AFP水平越高、肝癌恶性程度越高，B7-H3表达越强；B7-H3表达水平在伴有侵袭转移的肝癌中明显高于无侵袭转移的肝癌。该结果提示B7-H3分子参与了肝癌的发生、发展。此外，结合患者生存资料，发现B7-H3在肝癌中的表达水平和患者预后呈负相关。这与以前B7-H3分子在乳腺癌、卵巢癌、胃癌中的高表达报道一致［7-9］，显示B7-H3分子在肿瘤细胞异常表达与肿瘤进展密切相关。协同刺激分子是肿瘤微环境的重要组成部分，许多肿瘤细胞通过低表达正性协同刺激分子或高表达一些负性协同刺激分子，以达到逃避机体免疫系统的监控和杀伤目的。

肿瘤的发生、发展过程中均有免疫系统的参与，其中CD8+T淋巴细胞在肿瘤微环境中发挥着重要的抗肿瘤作用。其数量和功能的变化是评价机体抗肿瘤反应总体水平和患者术后预后判断的一个有效指标［10］。有研究证实，肝癌中CD8+T细胞高表达B7-H1的受体PD-1，PD-1+CD8+T细胞与正常CD8+T细胞相比，其增殖以及分泌效应因子的能力明显下降［11］。Sun等［12］发现B7-H3在肺癌组织中的表达水平和TILs的浸润程度呈负相关。Ma等［13］在小鼠的肝癌模型中，注射表达B7-H3的质粒载体与vasostatin联合应用，发现可以完全消除小鼠的肿瘤。进一步的研究发现上调B7-H3表达，可以增加肿瘤组织周围NK细胞的浸润，活化CD8+T细胞和NK细胞，增强两者杀伤肿瘤的功能。但本研究结果发现，B7-H3在肝癌中的表达水平与CD8+T细胞的浸润呈负相关，说明B7-H3可能参与了负调控CD8+T细胞介导的肿瘤免疫应答，最终导致肿瘤免疫逃逸的发生。

总之，本研究系统检测了B7-H3在肝癌组织中的表达情况，并对其与各临床要素之间的相关性进行了初步探索，表明B7-H3与肝癌的发生密切相关。但是B7-H3与肝癌的确切关系以及与患者的生存率关系尚需进一步观察分析。同时，B7-H3在肝癌的免疫调控中的作用及机制也有待于进一步明确。本研究结果表明，B7-H3分子有可能成为判断HCC转移及肝癌患者预后的一个新指标，抑制B7-H3表达有望成为抗肝癌免疫治疗的新策略。

［参 考 文 献］

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Expression and clinical significance of costimulatory molecule B7-H3 in human hepatocellular carcinoma

WANG Ling, CAO Na-na, SHAN Bao-en, CAO Yu, LI Jie, WANG Yan, XU Ying-ying (Tumor Research Institute, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

SHAN Bao-en E-mail: shanbaoen@yahoo.cn

Background and purpose：B7-H3 is a newly identified costimulatory family member, however, its exact role in human hepatocellular carcinoma (HCC) is still unknown. In the present study, we analyzed the expression of B7-H3 in HCC tissues and investigated its potential clinical role in HCC carcinogenesis. Methods：The expression of B7-H3 and the intensity of tumor infiltrating CD8+T lymphocytes in 71 surgically resected specimens, corresponding adjacent and normal liver tissues of HCC were evaluated by immunohistochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results：In these tumor specimens, 93.0% (68/71) samples were positive for B7-H3, while was almost negative in adjacent tissues and normal liver tissues. The B7-H3 mRNA level was also significantly increased in HCC tissues compared with adjacent and normal liver tissues (P＜0.05). The abnormal expression of B7-H3 was correlated with the level of AFP, TNM stage and the state of intrahepatic metastasis (P＜0.05). Meanwhile, the expression of B7-H3 in cancer cells was negatively correlated with the intensity of tumor infiltrating CD8+T lymphocytes (P＜0.05) and postoperative prognosis (P＜0.05). Conclusion：B7-H3 is overexpressed in the tissues of HCC, and B7-H3 expression is highly correlated with several clinical parameters. Moreover, overexpression of B7-H3 in HCC tissues can reflect CD8+T cell infiltration and may help tumor cells avoid immune surveillance. Therefore, B7-H3 plays important roles in early prediction, diagnosis and survival of HCC. Blockade of B7-H3 signaling pathway may have a therapeutic role in HCC treatment.

B7-H3; Human hepatocellular carcinoma; Immunohistochemistry

R735.7

：A

：1007-3639(2013)02-0081-06

2012-08-06

2012-10-29）

河北省卫生厅医学科学研究重点课题计划项目(No：20110481)。

单保恩 E-mail:shanbaoen@yahoo.cn

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.001