貂源犬瘟热病毒的分离与鉴定

陈 晨 张力燕 李 鹏 谢之景 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）

貂源犬瘟热病毒的分离与鉴定

陈 晨 张力燕 李 鹏 谢之景*（山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）

采用体外细胞培养技术，用MDCK细胞从潍坊与威海地区养貂户送检的6份疑似CDV感染的水貂病料分离到2株病毒。经常规病毒学鉴定，结果所分离病毒形态为CDV样病毒粒子，RNA病毒，不耐热、不耐高温、对脂溶剂敏感，抗CDV抗体能够特异性的抑制CDV在MDCK细胞内的增殖，用N基因的特异性引物能够扩增出CDV特异性N基因核酸片段。结果表明，所分离病毒为CDV，为进一步研究水貂CDV的分子生物学特征及研制水貂专用的CD弱毒疫苗提供了物质基础。

水貂 犬瘟热病毒 分离与鉴定

犬瘟热(Canine Distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper virus, CDV)引起犬科、鼬科、和浣熊科等动物的一种急性、高度接触性传染性疾病[1,2]。CDV可感染犬、狐狸、貉、狼、雪貂、虎、狮、大熊猫、小熊猫、熊等动物。CD广泛分布于世界各地，临床症状复杂多样，易继发细菌感染、与其他病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高达80%。随着我国国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，经济动物养殖业迅猛发展。水貂是重要的经济动物之一，但疫病严重危害养貂业的发展。CD是严重影响养貂业健康发展的重要疫病之一，CDV是引起水貂出血性肺炎的最重要病原，给养殖户造成很大的经济损失。本研究采用体外细胞培养技术，用MDCK细胞从疑似CDV感染的水貂病料中进行CDV的分离鉴定，为进一步研究水貂CDV的分子生物学特征及研制水貂专用的CD弱毒疫苗提供了物质基础。

1. 材料和方法

1.1 细胞、病料及CDV参考毒株

MDCK细胞辽宁出入境检验检疫局胡传伟副研究员惠赠，6份潍坊与威海地区养貂户送检的疑是CDV感染的水貂病料(肺、肝、肾、脾、淋巴结、脑等组织器官)，置-20℃冻存，待分离病毒。CDV、CPV、FPV和MEV参考毒株为本实验室分离保存的第6代MDCK细胞培养物。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 分别对6份水貂的肝、肾、脾、淋巴结、脑等器官组织剪碎研磨后，用DMEM营养液将病料制成1∶9悬液，4000rpm离心15min，取上清液，经0.22µm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冻存，待分离病毒。

1.2.2 病毒的分离培养 将处理好的病料样品按培养液体积的1/20-1/30同步接种刚消化分瓶的MDCK细胞，置5%CO2培养箱37℃静止培养，每天观察细胞的贴壁生长情况和CPE情况。如培养5d出现CPE，则将细胞培养物反复冻融3次，再将其按培养液的1/10接种MDCK细胞进行扩大培养至第5代，冻融3次，收毒，置-20℃保存，待鉴定。如培养5无CPE，则继续按常规细胞传代进行培养，如传至第5代仍无CPE，则视为分离病毒阴性。

1.2.3 病毒的常规病毒学鉴定 对所分离的病毒进行形态学鉴定、病毒核酸型鉴定、病毒耐热性试验、耐酸性试验、脂溶剂敏感试验、特异性试验，方法参照杨笃宝等报道的方法进行[3]。

1.2.4 RT-PCR扩增试验 对所分离病毒进行RT-PCR检测，方法参照杨笃宝等报道的方法进行[3]。

2 结果

2.1 病毒的分离

分别用处理的6份水貂病料接种MDCK细胞。其中2份病料接种MDCK细胞传至第五代出现典型的CDV样CPE，细胞肿胀变圆，颗粒物质增多，细胞间隙变大，呈现拉网样病变，细胞脱落，命名为CDV-M1与CDV-M2。其他4份病料接种的MDCK细胞传至第5代未出现CPE，视为病毒分离阴性。

2.2 病毒的鉴定

2.2.1 病毒的形态学鉴定 电镜下观察，CDV-M1与CDV-M2病毒粒子呈球形，核衣壳外面有囊膜包裹，膜表面有纤突。

2.2.2 病毒理化学鉴定及特异性 与对照组相比较，用5-IUDR处理的CDV-M1与CDV-M2细胞培养物的滴度小0.5个数量级，这表明CDV-M1与CDV-M2对5-IUDR不敏感；与对照组相比较，用高温处理的CDV-M1与CDV-M2细胞培养物的滴度低5个数量级以上，说明CDV-M1与CDVM2对不耐热；与对照组相比较，用盐酸处理的CDV-M1与CDV-M2细胞培养物的滴度低2个数量级以上，证明CDV-M1与CDV-M2不耐酸；与对照组相比较，用氯仿处理的CDV-M1与CDV-M2细胞培养物的滴度低2.6个数量级以上，表明对脂溶剂敏感；与对照组相比较，100单位的抗CDV抗体可使CDV-M1与CDV-M2的滴度降低3.1个数量级以上，说明抗CDV阳性血清能够特异性地抑制CDV-M1与CDV-M2在MDCK细胞内的增殖。见表1。

表1 CDV-M1与CDV-M2理化学鉴定及特异性试验结果

2.2.3 RT-PCR扩增试验 对CDV-M1进行RT-PCR扩增，扩增片段与CDV参考毒株的片段大小一致，与理论值相符合，约1.7kb。

图1 CDV-M1的RT-PCR扩增结果

3 讨论

（1）病毒分离 病料内存在许多毒性物质，会严重影响MDCK细胞的贴壁生长，所以初始可接种少量的病料处理物(按培养液的1/20-1/30进行接种)，这样会降低对细胞的毒性作用，提高病毒分离的成功率。（2）常规病毒学鉴定 电镜观察到CDV-M1与CDV-M2病毒粒子呈CDV样粒子；CDV-M1与CDV-M2对5-IUDR处理不敏感，是RNA病毒，并且对脂溶剂敏感、不耐酸、不耐热，与文献报道的CDV的理化性质一致[4-5]。抗CDV阳性血清能够特异性地抑制CDV-M1与CDV-M2在MDCK细胞内的增殖。结果表明CDV-M1与CDV-M2为CDV。（3）RT-PCR检测结果 根据GenBank中报道的CPV、FPV和MEV VP2核酸序列的差异，选择CDV的N基因核酸序列中的保守核苷酸作为CDV上下游引物的3′末端，设计CDV的特异性引物。所设计引物能够特异性的扩增CDV的相应片段，这表明所设计的CDV引物特异性很好，从分子水平证明所分离病毒是CDV。（4）CDV的流行状况CDV疫苗的应用曾控制了本病的流行，然而近年来CDV在我国水貂中仍广泛存在。母源抗体的干扰是造成免疫失败的主要原因。另外，CDV新变异株的出现也为CD的防治增加了困难。CDV在免疫压力下易产生新的突变。本研究为从分子水平进一步研究水貂犬瘟热病毒的生物学特征打下了基础，同时也为研制水貂专用的CD疫苗提供了物质基础。

[1] Gassen U, Collins FM, Duprex WP, et al. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J Virol 2000 Nov;74(22)∶ 10737-44.

[2] 何洪彬, 李金中, 夏咸柱等. 熊猫等动物犬瘟热病毒附着蛋白基因的遗传多样性[J]. 病毒学报, 2000, 17(3)∶ 238-241.

[3] 杨笃宝, 吕品, 胡传伟等. 狐源犬瘟热病毒泰安株(CDV-FOX-TA)的分离与鉴定[J]. 西南农业学报. 2008, 1∶ 204-207。

[4] Cherpillod P, Beck K, Zurbriggen A, et al.Sequence analysis and expression of the attachment and fusion proteins of canine distemper virus wild-type strain A75/17[J]J Virol. 1999 Mar;73(3)∶ 2263-9.

[5] Yoshida-E; Iwatsuki-K; Miyashita-N; et al. Molecular analysis of the nucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan[J]. Vet-Microbiol. 1998 Jan 16; 59(2-3)∶ 237-44.

S852.65+5

A

1007-1733(2013)10-0009-02

2013–07–29）

*通讯作者