骨松强骨颗粒的醇提取工艺研究

杜志谦牛琼琼夏华玲

（1河南省洛阳正骨医院中心实验室，洛阳，471002；2河南中医学院，郑州，450008）

中药研究

骨松强骨颗粒的醇提取工艺研究

杜志谦1，2牛琼琼2夏华玲1

（1河南省洛阳正骨医院中心实验室，洛阳，471002；2河南中医学院，郑州，450008）

目的：优选骨松强骨颗粒的醇提最佳工艺。方法：以提取液中淫羊藿苷含量，人参皂苷Rg1含量及总固体得率为指标，采用正交实验法，优选醇提工艺。结果：处方药材的最佳醇提工艺为70%乙醇10倍量，提取3次，1.5 h／次。结论：优选的提取工艺稳定可行。

正交实验法；骨松强骨颗粒；醇提工艺

骨松强骨颗粒处方是河南省洛阳正骨医院的经验方，由淫羊藿、三七、黄芪、骨碎补、葛根、附子、鹿角霜、何首乌组成，具有益气补肾、强筋壮骨、温阳通脉、理气止痛作用。该处方在临床应用10余年，疗效显著，安全性高，按新药开发拟制成颗粒剂。用于治疗原发性、继发性骨质疏松及骨软化症。根据所含的化学成分和药理作用结合功能主治，淫羊藿、三七、骨碎补、葛根4种药材采取醇提的方法。淫羊藿补肝肾，强筋骨［1］。淫羊藿所含的淫羊藿苷可促进骨细胞的分化成熟，促进成骨细胞的增殖［2］，为治疗骨质疏松的有效化学成分［3］。三七为贵重药材，三七所含的人参皂苷Rg1为其主要成分［4］，且含量较高。人参皂苷Rg1可增强机体免疫力［5］。因此，以淫羊藿苷含量和人参皂苷Rg1的含量及总固体得率为指标来优选提取条件，从而为制定生产工艺提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100 series液相色谱系统（美国安捷伦），XS205DU电子分析天平（瑞士梅特勒），HH-6金坛市科兴仪器厂水浴锅。

1.2 试药 淫羊藿、三七等药材均购自洛阳康鑫中药饮片有限公司，经河南中医学院董成明教授鉴定符合《中华人民共和国药典》2010版一部规定；淫羊藿苷对照品（110737-200415）、人参皂苷Rg1对照品（703-8903）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，其余为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 醇提液的制备 采用加热回流的提取方法［6］，选用L9（34）正交进行实验，以加醇量（A），提取时间（B），提取次数（C），醇浓度（D）为考察因素，进行4因素3水平的正交实验。因素水平见表1，一次称取处方量药材50 g，分别称取药材共9份，按表2加醇液提取，药液经过滤即得1～9号样品。

表1 因素水平表

2.2 淫羊藿苷含量的测定［7］

2.2.1 色谱条件［8-9］色谱柱安捷伦C18柱；乙腈∶水（28∶72）为流动相；检测波长270 nm；柱温35℃；理论塔板数淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取淫羊藿苷1.9 mg对照品，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.19 mg／mL的溶液，分别精密吸取0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，0.7 mL上述溶液，用甲醇分别稀释至1mL。过滤后分别吸取20μL注入液相色谱仪。按上述色谱条件测峰面积。以淫羊藿苷的浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标线性回归，得回归方程为Y＝39532X+66.986，R2＝0.9998，表明淫羊藿苷在0.019～0.133mg／mL范围内线性良好。

2.2.3 供试品溶液的制备［10］按处方量称取药材提取，精密移取提取液2 mL，蒸干，加稀乙醇，定容至10 mL。

2.2.4 对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品1.6 mg，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成每0.16 mg／mL的溶液。

2.2.5 阴性溶液的制备 称取处方量缺淫羊藿的其余药材提取，照供试品的制备方法制备阴性溶液。

2.2.6 含量测定 分别精密吸取过0.45μm滤膜的对照品溶液，供试品溶液、阴性溶液各20μL注入液相色谱仪。HPLC图见图1，结果见表2。

表2 L9（34）正交实验表

2.3 三七中人参皂苷Rg1含量测定［11］

2.3.1 色谱条件［12-13］色谱柱安捷伦C18；乙腈为流动相A，水为流动相B；检测波长为203 nm，柱温35℃；流动相比例如下图表3，理论板数按人参皂苷Rg1算应不低于4000。

表3 流动相比例

2.3.2 标准曲线的绘制 精密称取人参皂苷Rg1标准品12.5 mg，放入10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成1.25 mg／m L的溶液，分别精密吸取0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，0.7 mL的上述溶液加甲醇至1 mL。分别精密吸取20μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪。以人参皂苷Rg1的浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标线性回归，回归方程为Y＝7421.7X+105.86，R2＝0.9997，表明人参皂苷Rg1在0.125～0.875 mg／mL范围内线性良好。

2.3.3 供试品溶液的制备［14］按处方量称取药材50 g提取，精密量取乙醇提取液10 mL，蒸干加20 mL水溶解，水溶液用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，弃水液，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水液洗涤1次，每次60 mL，取正丁醇层，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

2.3.4 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品4.7 mg，加甲醇定容至10 mL容量瓶中。制成含人参皂苷Rg10.47 mg／mL的溶液。

2.3.5 阴性溶液的制备 按处方量称取缺三七的其余药材提取，照供试品的方法制备阴性溶液。

2.3.6 含量测定 精密吸取过0.45μm滤膜的对照品溶液，供试品溶液、阴性溶液各20μL注入液相色谱仪。HPLC图见图2，结果见表2，方差分析见表4。

2.4 总固体得率的测定［15］精密量取样品液30 mL至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后在105°C干燥箱中干燥5 h，于干燥器内冷却至室温，待恒重时精密称定，计算总固体得率，见表2。

2.5 结果 分析极差值知因素对结果影响大小顺序为：煎煮次数＞加水量＞煎煮时间＞乙醇浓度。由方差分析知各影响因素对结果影响都不显著，由直观分析知最佳组合为A1B2C3D3.即10倍醇液，每次煎煮1.5 h，煎煮3次，乙醇浓度为70%。

图1 为淫羊藿的HPLC图（注：A为淫羊藿苷的对照品溶液；B为样品溶液；C为阴性溶液；1为淫羊藿苷）

图2 三七的HPLC图（D为三七中人参皂苷Rg1的对照品溶液；E为样品溶液；F为阴性溶液图；2为人参皂苷Rg1）

表4 方差分析表

2.5.1 验证实验 分别称取药材以最优的工艺提取，按“2.2”和“2.3”项下测定淫羊藿苷含量和三七中人参皂苷Rg1的含量，测定总固体得率。验证3批结果差异无统计学意义。

3 讨论

淫羊藿苷含量测定时参照《中华人民共和国药典》2010版方法，由于复方组成的干扰，对流动项的比例进行了选择，调整为乙腈∶水为28∶72，就得到理想的峰形和保留时间。三七中人参皂苷Rg1的含量测定时供试品溶液的制备方法进行了优选：1）以乙醇提取液取10 mL，蒸干加甲醇溶解并定容至10 mL；2）先将乙醇提取液取10 mL蒸干加20 m L水溶解，水溶液用水饱和的正丁醇液萃取3次，每次20 mL，弃水液，正丁醇液合并，用正丁醇饱和的水液60 mL洗涤正丁醇液，取正丁醇液蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL；3）先将乙醇提取液10 mL蒸干加20 mL水溶解，水溶液用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，弃水液，正丁醇液合并，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤1次，每次60 mL，取正丁醇层，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。经比较第3种方法色谱图简洁，分离度好，保留时间合适，选择该方法为供试品溶液的制备方法。人参皂苷Rg1的含量测定经比较，优选了流动相比例，以流动相B为例，0～12 min为19，12～60 min为19～36；0～6 min为19，6～30 min为19～26；0～6 min为22，6～28 min为22～26；最终又改为比例0～6 min为21，6～28 min为21～26。

［1］孟宁，孔凯，李师翁.淫羊藿属植物化学成分及药理活性研究进展［J］.西北植物学报，2010，30（5）：1063-1073.

［2］孙晓玲，短小群.淫羊藿苷及衍生物药理作用研究进展［J］.华夏医学，2010，23（6）：807-810.

［3］李娌，王学美.淫羊藿苷药理作用研究进展［J］.中国中药杂志，2008，33（23）：2727-2731.

［4］谢清春，陈燕忠，吕竹芬，等.三七中人参皂苷Rg1的提取及含量测定［J］.中国医药导报，2010，7（34）：40-41.

［5］冯陆冰，潘西芬，孙泽玲.三七的药理作用研究进展［J］.中国药师，2008，11（10）：1185-1187.

［6］谭银合，孙维广，谭弘.丹龙抗痴胶囊提取工艺研究［J］.中国中医药信息杂志，2008，15（5）：56-59.

［7］中国药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2010版一部.北京：化学工业出版社，2010：306.

［8］林雪英，黄君曦.高效液相色谱法测定前列舒乐胶囊中淫羊藿苷含量［J］.海峡药学，2010，22（12）：73-75.

［9］叶咸钰，杨水新，曹恒斌.hPLC测定强筋合剂中淫羊藿苷的含量［J］.浙江中医药大学学报，2010，34（6）：920-921.

［10］申强，吕竹芬，谢清春，等.高效液相法测定祛痹舒肩丸中淫羊藿苷的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14（4）：16-18.

［11］毕晓黎，罗文汇，李素梅.HPLC-ELSD法测定三七止血胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：75-77.

［12］王雁.不同商品规格三七中3种皂苷的高效液相色谱法含量测定［J］.中药材，2005，28（1）：33-34.

［13］魏莉，杜奕，周浩.不同产地和生长年限三七花蕾中总皂苷及单体皂苷的含量测定［J］.上海中医药杂志，2008，42（4）：76-78.

［14］姚育端，傅钰，蒋平，等.高效液相色谱法测定三七伤药片中3组分的含量［J］.中国药房，2007，18（3）：206-207.

［15］于佳，刘瑶，张建玲，等.正交试验法优选舒郁煎膏水提工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：31-33.

（2013-04-28收稿）

Study on the Alcohol Extraction Process for Gusong Qianggu Granule

Du Zhiqian1，2，Niu Qiongqiong2，Xia Hualing1
（1 Henan Luoyang Orthopedic Hospital，Luoyang 471002，China；2 Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Objective：To optimize the alcohol extraction process of GuSong QiangGu Granule.M ethods：Orthogonal test was employed for selecting the optimum of alcoholextraction process by the indexes of the contents of ginsenoside Rg1 and total solidmatters.Results：Ten times amount of70%ethanol concentration，extracting 3 timeswith 1.5 hours for each time was considered the optimum alcohol extraction process of Gusonng Qianggu Granule.Conclusion：The optimum alcohol extraction process condition was stable and feasible. Key W ords Orthogonal test；GuSong QiangGu Granule；Alcohol extraction process

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.028

牛琼琼，女，在读硕士，研究方向：中药质量标准的研究，E-mail：niuqiongqiongmengjin＠126.com