益气活血法抗乳腺癌EMT6细胞增殖的荷瘤小鼠体内筛方研究

王 辉杜欣颖，3花宝金孙桂芝

（1中国中医科学院广安门医院肿瘤科，北京，100053；2中国中医科学院肿瘤研究所，北京，100053；3中国兵器工业北京北方医院，北京，100089）

实验研究

益气活血法抗乳腺癌EMT6细胞增殖的荷瘤小鼠体内筛方研究

王 辉1，2杜欣颖1，2，3花宝金1，2孙桂芝1，2

（1中国中医科学院广安门医院肿瘤科，北京，100053；2中国中医科学院肿瘤研究所，北京，100053；3中国兵器工业北京北方医院，北京，100089）

目的：筛选抗乳腺癌增殖的益气药、活血药适宜配伍。探讨益气药、活血药抗肿瘤的配伍的内在含义。方法：建立小鼠乳腺癌EMT6细胞BALB／C小鼠荷瘤模型。按照处理方式设立：空白对照组（Control）；紫杉醇组（Taxel）；黄芪+苏木组（HQ+ SM）；黄芪+苏木+蒲黄组（HQ+SM+PH）；黄芪+苏木+蜂房组（HQ+SM+FF）；黄芪+苏木+炮山甲组（HQ+SM+PSJ）；黄芪+苏木+蒲黄+蜂房组（HQ+SM+PH+FF）；黄芪+苏木+蒲黄+炮山甲组（HQ+SM+PH+PSJ）；黄芪+苏木+蜂房+炮山甲组（HQ+SM+FF+PSJ）；黄芪+苏木+蒲黄+蜂房+炮山甲组（HQ+SM+PH+FF+PSJ），共10组。成瘤小鼠共100只，随机分入以上各组中，每组10只。分别给予生理盐水、中药组方灌胃，生理盐水、紫杉醇注射液腹腔注射。观察成瘤后第8天，荷瘤重量。并计算抑瘤率。结果：黄芪+苏木+蜂房+炮山甲组肿瘤组织块重量明显小于空白对照组，差异具有统计学意义，P＝0.049＜0.05，该组抑瘤率为27.05%。结论：益气药、活血药组合黄芪+苏木+蜂房+炮山甲，具有抑制乳腺肿瘤EMT6细胞在BABL／C小鼠体内增值的作用。具有进一步研究价值。

益气；活血；乳腺癌；增殖

乳腺癌是严重威胁妇女生命健康的恶性疾病。在世界范围内，其发病率和死亡率居第三位［1］。近年来，多数学者认为益气活血法是乳腺癌中医药诊疗的重要治法。获得具有抗肿瘤作用的益气药、活血药的适宜配伍，是进一步研究益气药、活血药抗乳腺癌增殖、侵袭、转移的基础。根据既往实验研究结果，综合文献报道及临床运用实际，我们在本实验选取黄芪、苏木、生蒲黄、蜂房、炮山甲为候选药物，观察其不同组合抗小鼠乳腺癌EMT6细胞在BAB／C小鼠体内增殖能力的共性及差异，筛选适宜的益气药、活血药组合。

1 材料

1.1 动物 BALB／C小鼠，雌性，6～8周龄，体重（20 ±2）g，SPF级，由北京嘉轩科技有限公司提供，北京大学医学部实验动物科学部SPF级屏障环境喂养。

1.2 药物 黄芪浸膏，每克含生药2.8g，生产批号：20080308。苏木浸膏，每克含生药0.4g，生产批号：20100122。生蒲黄浸膏，每克含生药0.4g，生产批号：20091206。蜂房浸膏，每克含生药0.24g，生产批号：20100106。以上药物均由中国中医科学院广安门医院制剂中心提供。炮山甲煎液，自制，每毫升约含生药6g。紫素注射液，北京协和制药厂，批号：101011。

1.3 细胞株 EMT6乳腺癌细胞，由北京大学医学部免疫学系王露教授惠赠。

1.4 主要仪器 MLS-3750全自动消毒锅，日本SANYO。SARTRIOUS电子天平，北京赛多利斯天平有限公司。TE200-U倒置显微镜，日本NIKON。古威牌超净工作台，北京昌平长城空气净化工程公司。血细胞计数板，上海精密仪器仪表有限公司。

1.5 主要试剂 1640培养液，购自Hyclone公司。胎牛血清，购自Hyclone公司。青霉素、链霉素双抗，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。

2 方法

2.1 EMT6细胞复苏及培养 液氮中取出EMT6细胞，迅速置入38℃温水中，待冻存液融化，将冻存液转移至盛有10mL培养液的15mL离心管内，1000r／min离心5min，弃上清，2m L培养液重悬细胞，转移至25cm2培养瓶中，加入培养液至5mL，37℃5%CO2培养箱培养，适时传代。

2.2 EMT6细胞BALB／C小鼠荷瘤模型的建立 取传代后24hEMT6细胞，倒置显微镜观察细胞状态良好，细胞密度为70%左右，0.25%胰酶消化，培养基中和，10000r／min离心5min，3mL培养基重悬，台盼蓝染色并计数，调整活细胞密度为2×107个／mL，每只小鼠左侧腋下接种0.1m L肿瘤细胞悬液。接种后第4天观察，BALB／C小鼠左侧腋下瘤块直径＞0.4cm为成瘤，模型建立成功。

2.3 分组及给药 小鼠成瘤后，随机分组，每组10只，处理方法如下：接种后第5天开始给予各组处理。空白对照组予生理盐水灌胃+生理盐水腹腔注射；紫杉醇化疗组予生理盐水灌胃+紫杉醇腹腔注射；各治疗组予与其分组名相同中药组合汤剂灌胃+生理盐水腹腔注射。其中：生理盐水灌胃0.2mL／次，每日1次。生理盐水腹腔注射液0.2mL／次，每日1次。紫杉醇注射液以生理盐水稀释，小鼠腹腔注射剂量30mg／kg，0.2mL／次，每日1次。不同试验组中药复方灌胃，以生理盐水配制灌胃汤剂，黄芪剂量5g／kg，苏木剂量1.67g／kg，生蒲黄1.67g／kg，蜂房1.67g／kg，炮山甲1.67g／kg。

2.4 观察指标 瘤重和抑瘤率：于接种后第12天，即开始给药干预后第8天，将每组小鼠处死，剥离肿瘤组织，称取瘤重，计算抑瘤率。计算公式如下：

抑瘤率（%）＝［1-实验组平均瘤重（g）／对照组平均瘤重（g）］×100%

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，各组数据资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析。

表1 益气活血药不同拆方组合BALB／C荷瘤小鼠瘤重表

3 结果

经Shapro-Wilk检验，各组瘤重数值均符合正态分布。空白对照组（P＝0.503＞0.05）；紫杉醇组（P＝0.055＞0.05）；黄芪+苏木组（P＝0.774＞0.05）；黄芪+苏木+蒲黄组（P＝0.145＞0.05）；黄芪+苏木+蜂房组（P＝0.60837＞0.05）；黄芪+苏木+炮山甲组（P＝0.398＞0.05）；黄芪+苏木+蒲黄+蜂房（P＝0.478＞0.05）；黄芪+苏木+蒲黄+炮山甲组（P＝0.329＞0.05）；黄芪+苏木+蜂房+炮山甲组（P＝0.568＞0.05）；黄芪+苏木+蒲黄+蜂房+炮山甲组（P＝0.684＞0.05）。

Levene值＝1.206，P＝0.301，具有方差齐性。LSD法两两比较，空白对照组与其他处理组相比，其中黄芪+苏木+蜂房+炮山甲组与空白对照组差异有统计学意义，P＝0.049＜0.05。

表2 益气活血药不同拆方组合BALB／C荷瘤小鼠平均瘤重及抑瘤率表

图1 益气活血药不同拆方组合BALB／C荷瘤小鼠平均瘤重图

4 讨论

根据实验结果，可以初步确认，益气活血药物（黄芪+苏木+蜂房+炮山甲组合），在BALB／C小鼠活体内具有抑制乳腺癌EMT6细胞生长的作用，表现出良好的深入研究苗头。

据中医理论分析，该组合具有益气培本、活血通络、软坚攻毒的作用。结合中医学对肿瘤正虚邪实、瘀毒夹杂的病理特点，本实验最终筛药组合与中医理论相符合。近年来，益气活血法指导的中药方剂抗肿瘤研究逐渐得到诸多学者重视与研究，并在临床运用和基础研究中作了部分探索。王笑民等［2］从症候学角度研究发现，108名非小细胞肺癌患者中有60.20%的患者存在不同程度的气虚血瘀证，并提出T细胞亚群、血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、纤维蛋白原及纤维蛋白溶解酶等指标是改变气虚血瘀证的病理生理基础。徐咏梅等［3］报道，采用益气活血法为指导组方的固本抑瘤Ⅱ号能增强化疗疗效，减轻化疗毒副作用，并以血栓素、纤维蛋白原、6-酮-前列腺素F1α、纤溶酶等为指标，观察到益气活血法可减轻肿瘤患者化疗后的血液高凝状态。基础实验研究方面，郝钰、李东涛、李萍萍等［4-6］均报道，不同益气活血组方对肿瘤均有一定的抑制作用。

本研究药物组合中，黄芪为豆科黄芪属植物的根。甘、温，归肺、脾经。具有益气升阳，固表止汗，利水消肿，托毒生肌等功效。《本经》：主痈疽，久败疮，排脓止痛。《别录》：逐五脏间之恶血。《本草备要》：排脓内托，疮痈圣药。任美萍［7］等报道，黄芪多糖在体外以CCK-8法进行检测，发现其对K562、SMMC-7721、HCT116和A549细胞系无增殖抑制作用，而在体内可以提高荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平，并抑制荷瘤小鼠体内H22、S180肿瘤细胞的活性。张喜林［8］等报道，黄芪总提物能够降低HepA肝癌荷瘤小鼠血清ALT、AST及ALP水平，提高淋巴细胞含量，并能抑制抑制瘤的生长。陈坤［9］等报道，一定体积分数的黄芪注射液（3.45%和1.70%）具有促进人食管癌细胞株TE-13生长的作用，并且该促进作用有一定的计量依赖。

苏木为豆科芸实属植物苏木的心材。甘、咸、微辛、平。归心、肝、大肠经。具有活血祛瘀，消肿定痛等功效。《本草纲目》：三阴经血分之药。《医学启源》：破死血。《医林攥要》：补心散瘀，除血分妄作之风热。徐建华［10］等报道，苏木提取液在体外能够显著促进K562细胞的凋亡，且呈一定的剂量依赖关系。并可延长肝癌H22腹水小鼠的生存时间。

蜂房为胡蜂科胡蜂属昆虫黄星长脚黄蜂的巢。微甘、平、小毒，归肝、胃、肾经。具有攻毒消肿的功效。《本草汇言》：祛风攻毒，散疔肿恶毒。《外科全身集》：能托毒，疗久溃，止痛。报道，蜂房提取物在体外对多种肿瘤细胞存在抗增殖活性，其可以通过降低Bcl-2蛋白细胞内表达，诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞。但是蜂房提取物在高浓度下对造血干细胞具有毒性作用，低浓度确促进正常造血干细胞的增殖。［11］

炮山甲为鲮鲤科鲮鲤属动物鲮鲤的鳞片。经过锅内砂子武火炒热，拌炒至鼓起并呈金黄色而成。咸，微寒。归肝、胃经。《本草纲目》：通经络。下乳汁，消痈肿，排脓血。《本草再新》：解热败毒。炮山甲抗肿瘤作用的现代研究较少，多为临床经验报道。

在本研究中，紫杉醇组设置为阳性对照，具有较好的抑瘤率，但是进行统计发现，与空白对照组相比较，差异无统计学意义。考虑为样本量尚偏小所导致。单纯从抑瘤率角度进行分析，可以看到，具有炮山甲的药组与除炮山甲外其余药物均相同的药物组，其抑瘤作用均为明显。炮山甲是否能够作为抗肿瘤生长中药复方中的增效单味药，值得继续深入研究。结合现有文献报道，对于益气活血药单味中药抗肿瘤作用的研究，如黄芪、苏木等，具有学者发现剂量依赖等关系。因此，对于益气活血药物复方组合是否具有剂量依赖的抗肿瘤作用，仍然需要做大量的工作。

［1］周际昌.实用肿瘤内科学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：511.

［2］王笑民，郁仁存，王禹堂.晚期非小细胞肺癌患者气虚血瘀证的研究［J］.中国中西医结合杂志，1994，14（12）：724-726.

［3］徐咏梅，郁仁存.益气活血法治疗肿瘤经验.［J］.中医杂志，2010，51（6）：110-111.

［4］李东涛，吴志奎，孙桂芝等.益气、活血软坚、解毒法对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制的实验研究［J］.江苏中医药，2010，42（4）：74-75.

［5］郝钰，徐泊文，王伊光等.益气活血解毒方体内外抗肿瘤作用的实验研究［J］.中华中医药杂志，2005，20（10）：632-634.

［6］李萍萍，吕桂芝，孙红等.益气活血中药复方对肿瘤细胞增殖的抑制作用［J］.中国中药杂志，1996，21（2）：113-115.

［7］任美萍，刘明华，李蓉，等.黄芪多糖抗肿瘤活性研究［J］.中国新药杂志，2010，19（3）：221-224.

［8］张喜林，孛文虎，李路勇，等.黄芪总提取物抗肿瘤作用的实验研究［J］.中国现代药物运用，2010，4（4）：29-31.

［9］陈坤，高献书，卢付河，等.黄芪、参芪促肿瘤生长作用的观察［J］.河北医科大学学报，2004，25（1）：33-34.

［10］徐建华，郭素堂，乔丽娟，等.苏木提取液抑制肿瘤作用的研究［J］.肿瘤研究与临床，2006，11（8）：726-727.

［11］张坤，魏金荣，关一夫.蜂房提取物中抗肿瘤成分的活性研究［J］.中医杂志，2010，51（S2）：246-248.

（2013-10-30收稿）

A sp lit-side Research of Qi Boosting and Blood Quicken Formula’s Function in Inhibiting the Proliferation of Breast Cancer Cell EMT6 in a Tumor Burdened M ice M odel in Vivo

Wang Hui1，2，Du Xinyin1，2，3，Hua Baojin1，2，Sun Guizhi1，2
（1 Oncology Department of Guang’anmen Hospital affiliated to China Academy of ChineseMedicine Science，Beijing 100053，China；2 Cancer Institute of China Academy of Chinese Medicine Science，Beijing 100053，China；3 Northern Hospital of China North IndustriesGroup Corporation，Beijing 100089，China）

Objective：To get effective compatibility of Chinesemedicine herbs which would boost qi and quicken blood for inhibiting proliferation of breast cancer cells.And also to explore the connotation of herbs compatibility to treat cancer.M ethods：Breast cancer cell EMT6 burdened BALB／Cmicemodelwere established.Ten groupsweremade including control group（Control），Taxel group（Taxel），Huangqi+Sumu group（HQ+SM）；Huangqi+Sumu+Puhuang group（HQ+SM+PH）；Huangqi+Sumu+Fengfang（HQ+SM+FF）；Huangqi+Sumu+Paoshanjia（HQ+SM+PSJ）；Huangqi+Sumu+Puhuang+Fengfang（HQ+SM+PH+ FF）；Huangqi+Sumu+Puhuang+Paoshanjia（HQ+SM+PH+PSJ）；Huangqi+Sumu+Fengfang+Paoshanjia（HQ+SM +FF+PSJ）；Huangqi+Sumu+Fengfang+Fengfang+Paoshanjia（HQ+SM+PH+FF+PSJ）.100 tumor burden m ice were randomly divided into these ten groupswith tenmice in each group.Chinesemedicine formula and saline were administered intragastrically to different groups aswell as saline and Taxelwere given by interoperatoneal injection.The burdened tumorweightwasmeasured 8 days after forming the tumors and the tumor inhibition rate was observed.Results：The weight of burden tumor of the Huangqi+Sumu+ Fengfang+Paoshanjia group（HQ+SM+FF+PSJ）wasmuch smaller than thatof the control group.The differencewasstatistically significant，P＝0.049＜0.05.The tumor inhibition rat of（HQ+SM+FF+PSJ）group was 27.05%.Conclusion：The Chinesemedicine herbs compatibility with Huangqi，Sumu，Fengfang and Paoshanjia has the function of inhibiting the proliferation of breast cancer cell EMT6 in BALB／Cm ice in vivo.

Yiqi；Huoxue；Breast cancer；Proliferation

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.022

国家自然科学基金（编号：81072970）

王辉，男，30岁，浙江人，医学博士，研究方向：中西结合肿瘤临床与基础研究

孙桂芝，主任医师，教授，博士生导师，博士后合作导师，全国第四批名老中医，研究方向：中西结合肿瘤临床与基础研究，地址：北京市西城区北线阁5＃中国中医科学院广安门医院肿瘤科，邮编：100053，电话：010-88001192