γ分泌酶抑制剂DAPT对庆大霉素致大鼠耳损伤及修复过程中听力及Notch2/hes1信号通路表达的影响*

黄 飞 刘成福 王小琴

γ分泌酶抑制剂DAPT对庆大霉素致大鼠耳损伤及修复过程中听力及Notch2/hes1信号通路表达的影响*

黄 飞1刘成福1王小琴2

目的 观察γ分泌酶抑制剂DAPT对庆大霉素致大鼠耳损伤及修复过程中听力变化及Notch2/hes1信号通路表达的影响。方法 72只成熟大鼠随机分成三组，每组24只；对照组给予生理盐水3 ml·kg－1·d－1腹腔注射，连继10天，庆大霉素组给予Gen 120 mg·kg－1·d－1腹腔注射，连继10天，DAPT组给予DAPT 5 mg· kg－1·d－1腹腔注射，连用5天后停用2天，再用3天，同时腹腔注射Gen 120 mg·kg－1·d－1，连继10天。各组注射前及注射后1、14、28天进行ABR检测后处死动物，应用免疫印迹蛋白、实时定量PCR观察大鼠Notch2/hes1信号通路的表达。结果 对照组注射前后ABR反应阈无明显变化，与注射前相比，DAPT组和庆大霉素组注射后1、14、28天ABR阈值均明显升高，但随时间的延长阈值有所下降（P＜0.05），其中，第28天DAPT组ABR反应阈较庆大霉素组下降明显（P＜0.05）；与对照组相比，DAPT组和庆大霉素组Notch2/hes1的表达均明显增高（P＜0.05）；与庆大霉素组相比，DAPT组的Notch2/hes1表达明显降低（P＜0.05）。结论 在庆大霉素致耳损伤及修复过程中，DAPT可能通过抑制Notch2/hes1信号通路减轻耳蜗毛细胞损伤并促进耳蜗毛细胞修复，进而促进听功能恢复。

γ分泌酶抑制剂； Notch2/hes1信号通路； 庆大霉素； 听力； 大鼠

γ分泌酶抑制剂DAPT可能作为宫颈癌［1］和阿尔茨海默病新的治疗手段日益受到关注［2］。近年来研究表明，在体外培养胚胎期或新生的小鼠Corti器中加入γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路后，能使耳蜗产生额外的毛细胞［3，4］。hes1是Notch信号通路下游效应因子，参与了耳蜗的发育和调节毛细胞的分化［5］。实验显示，hes1过表达阻止Math1诱导的毛细胞分化，γ分泌酶抑制剂DAPT可阻止Notch信号通路的活化，进一步抑制了hes1和hes5的表达，这对内耳毛细胞的再生和修复可能起到重要作用［6］。本研究旨在通过观察γ分泌酶抑制剂DAPT对庆大霉素致大鼠听损伤及恢复过程中听力及Notch2/hes1信号通路表达的影响，为进一步研究耳蜗毛细胞损伤及再生提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 72只清洁级雄性成熟SD大鼠，体重150±10 g，由华中科技大学实验动物中心提供［许可证号：SCXK（鄂）2010－0009］，随机平均分成对照组、庆大霉素组、DAPT组，各组24只。

对照组腹腔注射生理盐水3 ml·kg－1·d－1，连继10天；庆大霉素组腹腔注射庆大霉素（湖北天药药业股份有限公司，批号：11205162）120 mg· kg－1·d－1，连继10天；DAPT组：腹腔注射DAPT（abcam公司）5 mg·kg－1·d－1，连用5天，停用两天后再用3天［7］，同时腹腔注射Gen 120 mg·kg－1·d－1，连继10天。

1.2 ABR测试 各组动物于注射前及停药后第1、14、28天分别测试ABR，操作在隔声屏蔽室内进行。大鼠用氯胺酮腹腔注射（350 mg/kg）麻醉后，将电极的正极置于动颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下，屏蔽耳机距测试大鼠外耳道口0.5 cm。用Danac－7型诱发记录系统给予交替短声（click）刺激，重复率20次/秒，带通滤波50～3 000 Hz，叠加200次，扫描时程20 ms。测试声强以5 dB逐次递减。以刚引出可重复的波III刺激声强度作为ABR反应阈。

1.3 耳蜗铺片标本制备 各组动物测试完ABR后，每组6只动物立即断头处死，速取同测听泡，充分暴露耳蜗后，在解剖显微镜下刺破蜗窗及前庭窗，蜗尖钻孔并缓慢注入含0.5%硝酸银溶液约1～2 ml，置于4%多聚甲醛中固定。

1.4 Western blot蛋白印迹检测Notch2/hes1表达 完成ABR测试后，每组6只大鼠行氯胺酮腹腔注射（350 mg/kg），麻醉后取出耳蜗内组织放入液氮中保存。耳蜗内组织总蛋白抽提试剂盒提取组织蛋白，放入管中，用匀浆器每30 s低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1 min，至组织完全裂解；裂解液于预冷的离心机中14 000 rpm离心15 min，取上清液，2：1加3×上样缓冲液（即取2单位上清液，加1单位3 ×上样缓冲液，至上样缓冲液终浓度为1×），100℃沸水浴变性3 min；BCA试剂盒测蛋白浓度；上样，使用DYY－6C电泳装置，样品首先在80 V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端，然后120 V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部，4℃下200 m V恒流2 h转膜；膜在5 BSA溶液中室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜（稀释比例1：3 000），TBST洗膜3～5 min；暗室中将膜置于反应液中室温孵育3 min，以X光胶片曝光，选出进行显影，定影。图片扫描保存为电脑文件，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.5 RT－PCR法检测Notch2－mRNA/hes1－mRNA表达 ABR测试后，每组6只大鼠行氯胺酮腹腔注射（350 mg/kg）麻醉后取出同侧耳蜗内组织放入液氮中保存。耳蜗内组织按Trizol Reagent试剂盒提取细胞总RNA，然后按TOYOBO First Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒操作说明进行反转录合成cDNA。对反转录产物进行PCR。反转录产物5μl，pl（100 pmol·L－1）2μl，p2（100 pmol ·L－1）2μl，10×Buffer 2.5μl，10 mmol·dBTPs 3 μl，Tap酶1μl，用超纯水补至终体25μl。定量PCR：①取0.2 mlPCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管；2×qPCR Mix，12.5μl，2.5 μM基因引物（表1），2.0μl，反转录产物，2.0μl，dd H2O，8.5μl。②取0.2 ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管；2×qPCR Mix，12.5μl，2.5μM内标引物，2.0μl，反转录产物，2.0 μl，dd H2O，8.5μl。③PCR扩增：预变性95℃，1 min；95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，20 s共进行40个循环，在72℃末段延伸5 min；最后溶解曲线72℃→95℃，每20 s升温1℃。最后采用△△CT法进行相对定量分析处理结果［8］：A＝CT（目的基因，待测样本）－CT（内标基因，对照样本）；B＝CT（目的基因，对照样本）－CT（内标基因，待测样本）；K＝A－B；表达倍数＝2－K。

1.6 统计学方法 计量资料用¯x±s表示，用SPSS19.0软件统计包对各组数据进行统计分析。多组间均数比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 目的基因引物序列

2 结果

2.1 ABR检测结果 由表2可见，DAPT组和庆大霉素组停药14天后，其ABR阈值比用药前明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；停药后28天与停药后1天也有明显差异（P＜0.05），DAPT组停药后28天的反应阈较庆大霉素组同期明显下降（P＜0.05）。

表2 各组用药前后ABR阈值比较（dB SPL，¯x±s）

2.2 耳蜗铺片结果 如图1所示，对照组耳蜗毛细胞基本正常，未见明显缺失或损伤；停药后第1天，庆大霉素组与DAPT组耳蜗毛细胞损伤或缺失明显，停药后第14天，庆大霉素组与DAPT组耳蜗毛细胞损伤或缺失明显，与停药后第1天比较，无明显改善；停药后第28天，庆大霉素组与DAPT组耳蜗毛细胞损伤或缺失明显减轻，与停药后第1天比较，有明显改善。

图1 各组大鼠耳蜗铺片观察结果 a为对照组，b～d分别为庆大霉素组停药后第1、14、28天；e～g分别为DAPT组停药后第1、14、28天

2.3 Western blot法检测Notch2、hes1蛋白表达结果 三组Notch2、hes1蛋白western blot检测结果见图2，k为对照组，M1～M3分别为庆大霉素组停药后第1、14、28天，D1～D3分别为DAPT组停药后第1、14、28天。

Alpha软件处理系统分析Notch2蛋白和hes1蛋白的光密度值如表3所示，在停药后第1天，庆大霉素组和DAPT组Notch2表达比对照组明显升高，在第14、28天，Notch2表达明显下降。

在停药后第1天，庆大霉素组和DAPT组比对照组hes1表达明显升高，在停药后第14、28天，hes1表达明显下降。

图2 Notch2、hes1及actin蛋白条带图 Notch2的分子量为72KD，hes1的分子量为34KD，actin的分子量为43KD

表3 各组Notch2蛋白和hes1蛋白的表达

2.4 RT－PCR法检测Notch2－mRNA、hes1－m RNA表达 marker电泳图从100 bp至600 bp逐步定位，β－actin 110 bp；Notch2－mRNA为291 bp；hes1－m RNA为105 bp（图2～4）（表4）。

图2 β－actin的marker定位电泳图

图3 Notch2的marker定位电泳图

图4 hes1的marker定位电泳图

如表4示，停药后第1、14、28天，与对照组比较，庆大霉素组和DAPT组Notch2－m RNA和hes1－mRNA的表达明显升高，同组停药后14、28天与第1天相比，Notch2－m RNA和hes1－m RNA的表达明显下降且DAPT组各时间点表达量比较庆大霉素组低（P＜0.05）。

表4 三组停药后不同时间Notch2和hes1的表达

3 讨论

Notch信号通路由Notch（1－4）受体、配体（DSI蛋白，哺乳动物是Jagged蛋白）和CSL（一类DNA结合蛋白）等组成。Notch配体N端有一个结合Notch受体所必需的DSI基序，当配体（如Delta）和相邻细胞的Notch受体结合后，Notch受体被蛋白酶体切割，释放出具有核定位信号的胞质区ICN（intracellular domain of Notch），进入细胞核与CSI结合，调节基因表达。Notch信号的靶基因多为碱性螺旋－环－螺旋类转录因子（basic heIix－Ioop－helix，b HIH），它们又调节其它与细胞分化直接相关的基因的转录。Notch2由一组高度保守的蛋白质组成，它们是细胞膜上的受体。Notch信号转导不需第二信使和蛋白激酶的参与，可直接接收邻近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达。hes1是Notch信号途径下游效应因子，参与了耳蜗的发育和调节毛细胞的分化［5］。在耳蜗，hes1基因突变后可引起内毛细胞数量增加；在前庭器官，hes1缺失会引起椭圆囊或球囊产生额外的毛细胞。

γ－分泌酶在Notch受体剪切并释放可溶的Notch胞内片段中起着关键的作用。有研究表明［9］，细胞表面的γ－分泌酶的蛋白水解作用是在细胞膜进行的，可以裂解细胞间的粘附结构并能释放胞间信号片段。γ－分泌酶抑制剂DAPT，阻止了Notch信号通路的活化，进一步抑制了hes1和hes5的表达，这对内耳毛细胞的再生和修复可能起到重要作用。近年来的研究表明［3］，在体外培养胚胎期或新生的小鼠Corti器中加入γ－分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路后，能够使耳蜗产生额外的毛细胞。同时发现，毛细胞的数目增多不是因为毛细胞的增殖引起的，而是通过支持细胞转分化来的。然而，Daudet等［10］研究发现在鸡胚的H H16－l7时期就开始持续用DAPT抑制Notch信号，可能会导致听觉斑的数量、大小及毛细胞的减少。

庆大霉素造成耳毒性的一般表现为延迟发生、渐进性加重的听力下降，这与氨基糖苷类抗生素对耳蜗毛细胞的损伤密切相关。文中结果表明，庆大霉素造成大鼠耳蜗毛细胞严重缺失，大鼠的听力明显下降，在停药后一月，毛细胞的缺失稍有减轻，听力明显好转；运用γ－分泌酶抑制剂DAPT进行干预后，大鼠耳蜗毛细胞的缺失有所减轻，听力下降也明显减轻。在停药一月的恢复过程中，耳蜗毛细胞的缺失比停药后一天明显减轻，听力的下降也明显减轻，说明DAPT组大鼠在一个月的恢复过程后，听力也有明显改善，实验中，Notch2/hes1信号通路抑制剂DAPT减轻了毛细胞的损伤，使其听力损伤有所恢复。

总之，Notch2/hes1信号通路通过抑制耳蜗毛细胞的再生参与了庆大霉素诱导的听力损伤，DAPT通过抑制Notch2/hes1信号通路而减轻毛细胞的损伤或促进了毛细胞的再生，使庆大霉素导致的耳蜗的损伤有所恢复。

1 Wei M，Lu X.Effects ofγ－Secretase Inhibitor DAPT on cell growth in human cervical carcinoma cell line hela［J］.J Liaoling Medical University，2010，10：390.

2 Yan H，Jiang F.Recent advances in the research ofγ－Secretase inhibitors［J］.Progress in Chemistry，2006，3：355.

3 Takebayashi S，Yamamoto N，Yabe D，et al.Multile roles of Notch signaling in clchlear development［J］.Dev Biol，2007，307：165.

4 Yamamoto N，Tanigaki K，Tsuji M，et al.Inhibition of Notch/RBP－J signaling induced hair cell formation in neonate mouse cochleas［J］.J Mol Med，2006，84：37.

5 Zine A，Aubert A，Qiu J，et a1.Hesl and hes5 activities are required for the normal development of the hair cells in the mammalian inner ear［J］.The Journal of Neuroscience，2001，21：4 712.

6 Mizutani T，Taniguehi Y，Aoki T，et al.Conservation of the biochemical mechanisms of signal transduction among mammlian Notch family members［J］.PNAS，2001，98：9026.

7 Kavian N，Servettaz A，et al.Targeting ADAM－17/Notch signaling abrogates the development of systemic sclerosis in a murine model.Arthritis，2010，11：3 477.

8 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－ΔΔCTmethod［J］.Methods，2001，25：402.

9 Chyung JH，Raper DM，Selkoe DJ.γ－Secretase exists on the plasma membrane as an intact complex that accepts substrates and effects intramembrane cleavage［J］.The Journal of Biological Chemistry，2005，280：4 383.

10 Daudet N，Ariza－Mc Naughtonl L，Lewis J.Notch signaling is needed to maintain，but not to initiate，the formation of prosensory patches in the chick inner ear［J］.Develpment，2007，134：2 369.

（2012－11－28收稿）

（本文编辑 李翠娥）

北京市耳鼻咽喉科研究所60周年庆典暨学术交流活动圆满成功

2013年4月19日上午九点，北京市耳鼻咽喉科研究所60周年庆典暨学术交流活动在北京国际饭店会议中心召开，学科同道和相关部门领导近500人参加了此次盛会。

庆典仪式由北京市耳鼻咽喉科研究所第五任所长、北京同仁医院副院长张罗教授主持，会议由一部反映耳研所六十年发展历程的短片拉开序幕。短片回顾了北京市耳鼻咽喉科研究所的历史，溯源至1953年北京市耳鼻咽喉医院的创建，它是我国第一个耳鼻咽喉科专业研究机构。老一代专家为耳鼻咽喉科事业潜心钻研、开拓进取，培养了一批在国内外享有盛誉的专家学者。历经60年积淀，在刘瑞华、徐荫祥、刘鋋和韩德民四任所长的带领下，耳研所在临床和基础研究多个学术领域一直保持着国内领先地位，成为教育部国家重点学科和重点实验室，为学科培养了大批高质量优秀人才。近10年获得国家科技成果二等奖3项，承担国家级科研项目68项，省部级项目111项。学科队伍高端人才涌现，包括教育部长江学者特聘教授、国家杰出青年，目前拥有教授15人、副教授14人；博士研究生导师9人、硕士研究生导师16人。历年培养博士后20人，博士研究生103人，硕士研究生242人。与美国和欧洲多所世界一流高校、科研机构积极开展针对性强的项目合作及人才培养，促进了耳研所在多个研究领域的快速发展和科技人才储备。

北京市耳鼻咽喉科研究所第三任所长刘鋋教授发表了致辞。远道而来参加庆典活动的耳研所最早的硕士毕业生之一，美国Ohio大学徐立教授代表我们向刘鋋教授献上了祝福的鲜花，祝老所长健康长寿。

北京市耳鼻咽喉科研究所第四任所长韩德民教授做了《润物无声》的主题演讲，深情地回顾了耳研所60年的发展历程和取得的丰硕成果。用无声的语言、丰富的资料、翔实的数据，展示了耳研所的文化传承，并对耳研所未来的发展寄予了厚望。北京市科技新星王向东博士代表耳研所全体同仁，向韩德民老师献上了鲜花。耳研所第一任所长刘瑞华教授的重孙女、新疆维吾尔自治区耳鼻咽喉头颈外科学会主任委员张华教授，向韩德民教授赠送了由刘瑞华教授1957年主编的《耳科学》原版专著。

北京市医管局潘苏彦副局长、北京市科委伍建民副主任、北京市中医管理局屠志涛副局长、首都医科大学管仲军副校长、中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会主任委员韩东一教授、中国聋儿康复研究中心胡向阳主任、欧洲鼻科学会前主席Anthony Papavassiliou教授先后致辞，热烈祝贺北京市耳鼻咽喉科研究所成立60周年，期待国家重点学科的明天更加美好。北京同仁医院伍冀湘院长在致辞中用“震撼”两个字来形容参加此次活动的感受，为同仁医院100多年厚重的历史所震撼，为同仁医院的两个重点学科而震撼。伍院长说，“我感到肩上的担子非常重，我要为你们打造平台！让你们放飞梦想！伴随着我们中华梦的实现，实现我们的同仁梦！实现我们耳鼻咽喉头颈外科的梦！”

最后，美国加州大学洛杉矶分校牙学院副院长、美国国家医学院王存玉院士，北京市人大教科文卫体委员会史炳忠主任委员，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科分会高志强候任主任委员，北京市眼科研究所王宁利所长，首都医科大学科教处龚树生处长，和韩德民教授一起，为耳研所的新所标揭幕。随着新所标的冉冉升起，庆典活动落下帷幕。

庆典活动后，精彩的学术交流活动在来自美国的王存玉院士“阴阳文化与医学研究创新”和中国工程院程京院士“新生儿遗传性耳聋基因筛查”的专题报告中开始。澳大利亚籍听力学家许时昂教授用感人的语言、丰富的画面描述了“我与耳研所的情结”。Anthony Papavassiliou教授，韩国耳鼻咽喉头颈外科协会候任主任委员Kyung Tae教授，意大利Femo医院耳鼻喉科主任Stefano Dallari教授，美国伊利诺大学医学系呼吸及心血管内科萧镭教授等分别作了“无创矫正鼻软骨畸形、鼾声记录－鼾症诊断新技术”；“机器人手术在头颈外科手术中的运用”、“CO2激光在耳科手术中的运用”、“转录因子PU.1在过敏性炎症中的作用”。最后，由耳研所自身培养出的、现在美国俄亥俄大学听力言语系工作的徐立教授，美国南卡罗来纳医科大学郎海南教授汇报了他们在美国的工作重点和在“声调语言与人工耳蜗”和“耳蜗神经再生”研究领域中所取得的成就。讲者们关于国内外相关领域的最新研究成果和新技术的报告，与会的国内同道深感兴趣，纷纷提问，与讲者进行了深入的讨论。

伴着浓浓的学术气氛，隆重而丰富多彩的北京市耳鼻咽喉科研究所60周年庆典活动圆满落幕。一系列学术活动同期开始，青年团支部的“科技文化沙龙”、第九届听力眩晕疾病诊疗技术研讨班、第十三届同仁鼻科学论坛、中耳力学研究与耳微创外科研讨会、《中国耳鼻咽喉头颈外科》、《国际耳鼻咽喉头颈外科杂志》和《中国医学文摘耳鼻咽喉科学》2013年编委会暨新思维及新技术研讨会，为所庆活动增添了丰富的内涵。

Effects of DAPT on Hearing and Notch2/hes1 Signaling Pathways Expression in Gentamicin－induced Hearing lnjury and Repair Process in Rat

Huang Fei*，Liu Chengfu，Wang Xiaoqin
（*Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan，430065，China）

Objective To study the effects of DAPT on hearing and Notch2/hes1 signaling pathways expression in gentamicin－induced hearing injury and repair process.Methods Seventy－two mature rats were randomly divided into the normal group（saline，intraperitoneal injection，3 ml·kg－1·d－1，held following the ten days），model group（Gen，120 mg·kg－1·d－1，intraperitoneal injection，continuous ten days）and DAPT group（Gen，120 mg· kg－1·d－1，intraperitoneal injection，continuous ten days；DAPT，5 mg·kg－1·d－1intraperitoneal injection，held following the five days，continuous three days after stop two days）.Hearing changes were evaluated by auditory brainstem response（ABR）at pre－modeling and 1，14，28 days post－modeling.The expression of the Notch2/hes1 was detected by western－blotting and real－time quantitative PCR，at 1，14，28 days post－modeling.Results Auditory brainstem response（ABR）showed that the normal group had no significant change.Compared with those of before treatment，the ABR threshold were significantly higher and decreased with time in model group and in the DAPT group（P＜0.05）.Real－time quantitative PCR and western－blotting showed that compared with the normal group，the expression level of Notch2＼hes1 was significantly higher at 1，14，28 days in the model group and in DAPT group（P＜0.05）.The expression level of Notch2＼hes1 had evident decreae in the DAPT group compared with that of in the model group（P＜0.05）.Conclusion DAPT may reduce the hair cell damage and promote the repairof the hair cells by inhibiting Notch2/hes1 signaling pathways，thus contributing to the recovery of the hearing.

DAPT； Notch2/hes1； Gentamicin； Hearing； Rat

（耳研所程晓华黄丽辉刘博供稿）

10.3969/j.issn.1006－7299.2013.03.018

时间：2013－5－6 15：45

R764.5

A

1006－7299（2013）02－0272－05

* 国家临床重点专科建设项目资助

1 湖北中医药大学中医临床学院（武汉430063）； 2 湖北省中医院肾内科

黄飞，男，湖北人，主治医师，主要研究方向：中医药防治肾病。

王小琴（Email：wangxiaoqin3＠sohu.com）

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20130506.1545.020.html