中医证候实质与表观遗传学相关性初探

牟 新 杭州市红十字会医院 杭州 310003

·学术探讨·

中医证候实质与表观遗传学相关性初探

牟 新 杭州市红十字会医院 杭州 310003

表现遗传学 中医证候 理论探讨

辨证论治是中医学的特色之一，是构成中医理论体系的重要组成部分，是临床医疗实践准则，在临床诊疗过程中，方从法出，法随证立，可见“证候”是诊疗过程的核心内容，是立法遣药组方的依据，所以正确的辨证在临床工作中有着十分重要的意义。但是，因为中医有着独特的理论体系，所以疾病的诊疗过程与西医不完全相同，它是通过对疾病表现出来的纷繁复杂现象进行客观分析，通过“审证求因”，进行个体化辨证治疗。这种个体化诊疗表现在不同医生对疾病的病因病机的把握上，正是由于这种辨证个体之间的差异导致了研究进展的滞缓。

建国以来，中医的基础研究引领着中医临床学科的发展和创新，其中对“证候”实质的探讨方兴未艾，相继开展了证候规范化、证的实质和证的动物模型的研究，在此基础上还引入现代流行病学和医学统计学等研究方法对疾病的证候规律和演变进行了大量临床研究，也取得了不少引人注目的研究成果。然而，对中医证型的分布和中医“证”的实质缺乏系统研究，为辨证的客观化、标准化带来了一定的困难，制约了中医临床研究水平和疗效的进一步提高。可见，开展证候的研究仍有重大的现实意义，对中医的学术发展也将有重要的影响。

王永炎院士曾提出证候具有“内实外虚”、“动态时空”和“多维界面”的特点［1］，目前证候学研究主要集中在“证候”本质研究和“证候”规范化研究两个方面。

1 证候实质的研究

证候实质的研究是中医证候规范化的基础，它是中医基础理论研究的主要领域，是运用包括分子生物学、现代流行病学、医学统计学、遗传学在内的现代自然科学多学科理论、方法与手段，在中医传统理论指导下探索中医证候实质的科学研究，对于将中医药理论用现代自然科学的方式方法进行阐明有着举足轻重的作用。

不同的疾病会产生不同的证候，同一疾病的不同发展阶段其证候也不尽相同，正如现代医学认为的同一种疾病的不同发展阶段，其生化、病理学指标也随之进展一样，相同的证候也可能存在共同的物质基础，而这种物质基础或许能反应在基因、细胞、分子等微观水平上。因此，通过对疾病的生理、病理、生化等方面的客观指标进行分析，可以进一步揭示证候的内在机制，并且可以把这些客观指标用于疾病证候诊断的必要补充。

刘莺［2］认为，基因组学与中医学两个学科在思维方法上的趋近特征，显示了研究思路与方法相互渗透的可能性。通过中医证候学与致病（易感）基因研究，有助于积极预防证候的转变。通过中医证候表达谱的研究，可以提高辨证的可信度和准确度，对阐明基因与证之间的联系，对认识疾病的发生机制、预测疾病的转归都会发挥重要作用。刘为民［3］提倡将蛋白质组学引入中医证候分类及证候演变规律的研究中，认为就分子水平而言，证候不一则基因表达谱也不一样，证的本质是基因型及其表达，例如基因及其 mRNA、蛋白质水平差异是症状和体征变化的分子基础。李戎等［4］认为利用基因芯片技术，对不同个体的“证”状态的基因组进行扫描，绘出不同证的基因表达谱、通过计算机分析来建立“证”相关谱，可望从基因水平为“证候”的规范化、标准化和现代化研究提供可能。吕仁和等［5］将临床表现和内生肌酐清除率（Ccr）结合进行积分定量，拟定了慢性肾炎（前期）中医辨证和疗效评定规范方案。徐志伟等［6］为探索实热证、虚热证本质，对甲状腺超微结构和功能进行研究，结果发现，热证的大鼠甲状腺激素水平变化与甲状腺组织上皮细胞超微结构的变化呈平行关系。

郑洪新［7］认为，宏观与微观结合研究中医证候病机需要特别注重保持中医特色，发挥中医优势；立足于宏观的中医证候病机研究方法，进行微观、超微研究；认识普遍性，探求特殊性；采用定性、定量相结合的综合集成研究方法；注重掌握相对的、辨证的、动态的观察分析综合病理机制的方法，对时间、空间、条件等因素加以严格限制，恪守对照、均衡、随机、重复四大原则，对研究结果不能片面地加以绝对化或过分追求“理想化”。郭蕾等［8］认为证候与理化指标之间的非线性关系主要表现为非独立性方面。目前尚未找到具有相对排他的某一或某些理化指标可以作为某一证候的判断标准。李喜悦等［9］认为血浆蛋白质组学是对血浆中某一时段的全部蛋白质的表达和功能模式进行研究，可以在以往证候研究基础上，对不同证候血浆进行分析，找出与其相关的一过性、阶段性和持续性变化的功能蛋白，并很可能成为中医者长期以来寻找的证实质。李梢［10］从网络的角度展开对证候生物学基础的探索，建立了从“表型网络-生物分子网络-药物网络”理解病证方关系的研究框架，由此进一步提出证候生物分子网络标志的构想，并进行了寒证与热证的案例研究。简维雄等［11］等通过对代谢组学与中医证候整体性关系、时空性关系，以及结果分析时降维的关系比较，认为代谢组学与中医证候在分析问题及解决问题方面具有相同的思维。王忠等［12］认为证候是多种基因参与的，且已经超过了人体正常的网络调节能力，是处于络病状态的症状群。基因的差异性是证候之间差别的物质基础，又是确定其所代表的症状在疾病证候中重要性、贡献度的依据。申维玺［13］认为中医证的本质是细胞因子。

从上述研究我们欣喜的看到，随着一些新理论（如系统论、控制论、信息论和耗散结构理论、证候晶体学等）的提出和新方法（蛋白质组学、代谢组学、基因芯片、量表和问卷、隐结构分析）的应用，使得证候实质的跨学科研究成为主流的研究方法。因此，在汲取现代研究成果的同时，通过进一步研究、完善证候宏观标准，这无论是对于促进证候标准的规范化、客观化，还是证的本质的研究都具有十分重要的意义。

“证候”本质研究虽然随着实验室检测手段的不断发展，目前从不同角度及层次发现了部分与“证”相关的实验室检测指标，认为这些指标可用于揭示中医“证”的本质。但是对证候实质的研究进行整体综合考察，目前尚不能找到某一个或某一组对于某一个证候有非常特异性的客观指标。我们认为，作为疾病发展过程中的某一阶段的病理概括，证候除了受到先天体质因素的影响之外，更重要的是受到了环境、生活习惯等后天因素的影响，而表观遗传学恰恰是研究这些因素对疾病影响的一门学科，因此我们试图探讨两者之间是否存在关联性。

近年来，随着表观遗传学（epigenetics）研究的深入，显示环境和个人的选择可以影响基因而不涉及基因编码的改变。这与证候的动态性和受后天环境因素影响较大的特点较为贴近。因此，我们通过一个角度探讨中医证候的多样化和表观遗传学的相关性，试图揭示证候学理论的实质。

2 表观遗传学研究进展

遗传学告诉我们，通过基因结构的改变会可以引起生物体表现型（phenotype）的改变，而且这种改变可以从上一代传到下一代。而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，基因表达的改变也可以导致可遗传的表现型变化如DNA甲基化和染色质构象变化等，这种表现型变化没有直接涉及基因的序列信息。于是，遗传学的研究又开辟了一个新的领域—表观遗传学。

表观遗传学虽然是在上世纪80年代后期就已经逐渐兴起，但却是在2000年以后才真正受到广泛重视并取得了一系列进展，目前已经成为当今生命科学研究的前沿和热点。1999年在欧洲成立了人类表观基因组协会，把解析人类DNA甲基化谱以及进行“基因组的表观遗传可塑性研究计划”作为主要任务，并拟绘制不同组织类型和疾病状态下的人类基因组甲基化可变位点的图谱［14］。

目前，表观遗传学研究主要集中在DNA的甲基化、组蛋白密码和染色质重塑、非编码RNA调控等方面，而DNA的甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。在脊椎动物中，DNA启动子区CpG岛成簇状存在，它是DNA发生甲基化的主要位点，所以研究DNA甲基化常与CpG岛相关联，目前对DNA启动子区CpG岛异常甲基化的研究是表观遗传学的一个热点［15-16］。

Srinivasan等［17］研究发现，对新出生的雌性幼鼠采用人工喂养高糖牛奶的方法，可以导致慢性高胰岛素血症和成年发病的肥胖，而且这种高胰岛素血症和肥胖表现型可以继续传给它们的下一代，但是通过轻微的饮食控制就可以逆转甚至也可以在它们的后代中预防这种表现型的发生。因此，有研究者提出从某种意义上讲，2型糖尿病也一种表观遗传性疾病［18］。

而在糖尿病肾病的发病机制方面，有研究显示，高同型半胱氨酸血症、高血脂、炎症和氧化应激等因素都可促进DNA的异常甲基化，从而导致糖尿病肾病的发生［19-21］。而且糖尿病肾病和“代谢记忆效应”有关，基因与环境的关系可以导致染色质的特异变化，而早期强化治疗控制血糖有长期的代谢性记忆效应及减少糖尿病肾病和其他糖尿病并发症的发病率，其机制可能和表观遗传学有关［22-23］。而在1型糖尿病患者中，有研究者也发现DNA的甲基化和糖尿病肾病患者的年龄、起病时间和性别相关，而且证实了19个CpG岛和糖尿病肾病进展相关［24］。有研究者对出现慢性终末期肾病的糖尿病肾病患者和单纯的2型糖尿病患者的基因甲基化进行筛选，发现了187（21%）个候选基因存在差异［25］。

3 中医证候实质与表观遗传学

我们曾对360例2型糖尿病和糖尿病肾病患者进行横断面研究［26-27］，对糖尿病肾病人群不同体质类型、不同证候及其与TGF-β1基因T869C多态性的内在关联及其交互作用进行分析，发现糖尿病肾病的部分体质和TGF-β1基因T869C基因多态性有一定的相关性［28］。而我们对糖尿病肾病患者的证候与TGF-β1基因T869C多态性进行二分类logistic回归分析，发现最后无相关证候进入回归模型。我们认为这与证候的动态性和受后天环境因素影响较大有关，因此，有必要引入表观遗传学的研究方法进一步探究证候的实质，见图1。

图1 中医体质学和证候学的物质基础

从以上研究可看出目前中医在证候实质的研究方面，已经取得了许多进展，但由于证候的复杂性，很难从微观的角度寻找诊断某一证候的实验室指标。随着现代科学技术的发展，以期从表观遗传学有所突破。

基于此，我们提出表观遗传学是中医证候多样性的部分物质基础这一假说，认为以基因多态性为代表的遗传学改变是中医体质易感性的物质基础，发病后出现的证候多样性则和表观遗传学改变更为相关，不同发病途径的DNA甲基化导致了不同的证候，而这恰恰丰富了疾病的发生不外“先天禀赋和后天失养”这一中医病因学的内容。这些表观遗传学的微观指标可以作为中医证候宏观辨证的必要的补充，对探究证候的实质提供了新的理论思路。

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2012-12-12

国家自然科学基金资助（No.81273623）