Bcl-2基因抑制神经细胞凋亡的实验研究

韩贵和 魏 威 顾 军 汪翼凡 应小樟 杭州市红十字会医院骨科 杭州310003

·论 著·

Bcl-2基因抑制神经细胞凋亡的实验研究

韩贵和 魏 威 顾 军 汪翼凡 应小樟 杭州市红十字会医院骨科 杭州310003

目的：观察原癌基因bcl-2对神经细胞凋亡的抑制作用。方法：培养PC12细胞至对数生长期，用100感染复数（multiplicity of infection，MOI）的携带bcl-2基因的慢病毒质粒及未携带bcl-2基因的慢病毒质粒感染PC12细胞。再将其分为A、B、C、D四组，A组为携带bcl-2基因慢病毒质粒的PC12细胞（bcl-2-PC12细胞），B组为未携带bcl-2基因慢病毒质粒PC12细胞（NC-PC12细胞），C组为bcl-2慢病毒质粒PC12细胞加H2O2（bcl-2-PC12细胞+H2O2），D组为NC慢病毒质粒PC12细胞加H2O2（NC-PC12细胞+H2O2）。应用流式细胞仪检测细胞的凋亡率，采用BCA（bicinchoninic acid）法检测bcl-2基因表达蛋白。结果：A组细胞凋亡率低于B组（P＜0.05），C组细胞凋亡率低于D组（P＜0.05）；A组bcl-2基因蛋白浓度高于B组（P＜0.05），C组bcl-2基因蛋白浓度高于D组（P＜0.05）。结论：bcl-2基因对正常神经细胞的凋亡有抑制作用，能够增强神经细胞的抗损伤能力。

bcl-2基因 神经细胞 凋亡

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可导致严重的神经系统功能障碍，如截瘫和四肢瘫。目前尚无一种方法能使SCI患者的神经功能得以明显恢复。基因治疗（gene therapy）是当前生物医学研究迅猛发展的领域之一［1-2］，有望改善SCI患者的神经功能。自1997年Chen等发现原癌基因bcl-2能促进哺乳动物切断的中枢神经轴突的再生后，众多学者对bcl-2基因的作用进行了探索，并且取得了令人瞩目的研究进展［3-4］。PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的神经细胞株，常用于实验研究。本研究对bcl-2基因抑制PC12细胞凋亡及增强其抗损伤的作用做了一些探索，获得了满意的结果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM培养基（美国Gibco公司）、H2O2（无锡市晶科化工有限公司）、胎牛血清（FBS，兰州民海生物有限公司）、马血清（HS，美国Hyclone公司）、胰蛋白酶（美国Gibco公司）、Alexa Flour 488 annexin V∕Dead Cell Apoptosis Kit（美国Invitrogen公司）。

1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱（3111型，美国Thermo公司）、倒置荧光显微镜（DMIL型，德国Leica公司）、台式离心机（上海医疗器械有限公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.3 PC12细胞和慢病毒质粒 PC12细胞（购于中科院上海细胞库）、携带bcl-2基因的慢病毒质粒（bcl-2慢病毒质粒，购于上海吉玛生物公司）、不携带bcl-2基因的慢病毒质粒（NC慢病毒质粒，购于上海吉玛生物公司）。

1.4 细胞培养 从液氮罐复苏PC12细胞，10%FBS+ 5%HS，1×青-链霉素DMEM培养基，37℃，5%CO2培养箱，传代2～3次使细胞完全恢复。

1.5 慢病毒质粒转染 取对数生长期PC12细胞胰酶消化，1 200r∕min离心5min，收集细胞，以DMEM完全培养基轻轻吹打混匀细胞，细胞计数，以1×105∕孔细胞量铺布6孔培养板，待细胞完全贴壁后细胞汇合度50%左右，换新鲜培养基准备转染。用100感染复数（multiplicity of infection，MOI）病毒感染PC12细胞。

1.6 H2O2损伤细胞 将转染bcl-2慢病毒质粒的PC12细胞及转染NC慢病毒质粒的PC12细胞，取对数生长期细胞胰酶消化，细胞计数，以1×105∕孔细胞量铺布6孔培养板，各组细胞弃旧培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，换上无血清DMEM孵育24h使细胞同步化。弃旧培养液，PBS液清洗2次。将上述两种细胞分为A、B、C、D四组，即A组为单纯bcl-2慢病毒质粒PC12细胞（bcl-2-PC12细胞），B组为单纯NC慢病毒质粒PC12细胞（NC-PC12细胞），C组为bcl-2慢病毒质粒PC12细胞加H2O2（bcl-2-PC12细胞+ H2O2），D组为NC慢病毒质粒PC12细胞加H2O2（NC-PC12细胞+H2O2）。C、D组细胞以1mmol∕LH2O2作用1h对其进行损伤。

1.7 PI染色流式细胞术检测细胞凋亡 胰酶消化上述细胞，1 200r∕min离心5min，收集细胞，用4℃PBS液洗涤2次，加入100μL1Xannexin-binding buffer溶解，按照凋亡检测试剂盒操作，依次加入5μLAnnexin V和1μL100μg∕m lPI，孵育15min，再加入400μL1Xannexin-binding buffer后上机检测。

1.8 Western blot法检测bcl-2基因表达蛋白

1.8.1 蛋白样品制备 吸取细胞培养液1mL，备用。每瓶细胞加2mL 4℃的PBS，轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的4℃细胞培养液中。1 200r∕min离心5min，收集细胞，小心吸除上清液。PBS洗涤1次，吸除上清液后加1mLPBS重悬，将细胞转移到1.5mL离心管中，1200r∕min离心5min，收集细胞。按1mL裂解液加10μL PMSF（100mM），混合均匀。每瓶细胞加100μL含PMSF的裂解液，在4℃下裂解30min，为使细胞充分裂解，EP管要经常摇动。裂解完毕，于4℃、12 000r∕min离心10min。将离心后的上清液转移到新的离心管中，于-70℃条件下保存。

1.8.2 BCA（bicinchoninic acid）法测定蛋白浓度将0.5mg∕mL标准牛血清蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20μL分别加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。样品用标准品稀释液稀释一定浓度后加20μL到96孔板中。按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min。测定562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

1.9 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行统计分析，先做正态性分析，数据以均数±标准差（）表示。细胞凋亡的分布符合二项分布，故细胞凋亡率的比较采用U检验。蛋白浓度服从正态分布，进行F检验，成组资料t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 bcl-2基因对PC12细胞凋亡率的影响 A组细胞凋亡率8.11%较B组15.63%低（U=2.16，P＜0.05），C组细胞凋亡率12.27%较D组26.38%低（U=2.38，P＜0.05）。说明bcl-2基因可抑制PC12细胞的凋亡，增强PC12细胞的抗损伤能力，见图1。

图1 细胞凋亡率图示

2.2 bcl-2基因对PC12细胞表达蛋白的影响 A组bcl-2基因表达蛋白浓度高于B组（t=2.87，P＜0.05），说明A组存活细胞数多，bcl-2基因表达蛋白浓度高，bcl-2基因具有抗凋亡作用。C组bcl-2基因表达蛋白浓度高于D组（t=2.87，P＜0.05）。说明在细胞受到损伤时，bcl-2基因表达蛋白浓度高的细胞，抗损伤能力强，证明bcl-2基因具有增强神经细胞的抗损伤作用。见表1。

表1 bcl-2蛋白浓度（） μg∕L

表1 bcl-2蛋白浓度（） μg∕L

注：与D组比较，△P＜0.05

组别A组B组C组D组n 10 10 10 10蛋白浓度0.56±0.02 0.46±0.02 0.32±0.02△0.18±0.02

3 讨 论

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可导致严重的神经系统功能障碍如截瘫和四肢瘫。SCI造成的影响比较广泛，可影响到运动、呼吸、消化、泌尿和生殖系统等多个器官的正常功能。目前，国内外在脊髓损伤的综合治疗方面主要采取以下两个策略：①在急性期使用神经保护剂，以阻止损伤的进一步发展。这种疗法包括提高氧合能力、清除自由基及各种生化紊乱。②在亚急性期和后期使用神经营养因子（neurotrophic factors，NTF）以防止神经元营养匮乏并促进轴突生长，也可联用神经元移植和遗传工程细胞导入的方法；同时采用与髓鞘形成有关的抑制蛋白抗体来促进轴突的长距离再生能力。遗憾的是，目前尚无一种方法能使SCI患者的功能得以明显恢复。

基因治疗（gene therapy）是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。原癌基因Bcl-2是一种与细胞凋亡密切相关的癌基因。1997年Chen等发现Bcl-2基因能促进切断的哺乳动物中枢神经轴突的再生，第一次为脊髓损伤后的神经元再生提供了理论依据［5］。Takahashi等［6］研究发现，在脊髓损伤后注射携带Bcl-2基因的DNA质粒能减少神经元的凋亡。Shimazaki等［7］利用腺伴随病毒载体转导Bcl-2基因至中枢神经系统进行表达，证实了转导基因治疗中枢神经损伤—脑缺血再灌注损伤的可能性。已有大量文献［8-10］表明，无论体内还是体外，bcl-2基因对于损伤导致的神经细胞凋亡有明显的保护作用。本研究结果显示，转染携带bcl-2慢病毒的PC-12细胞组（A组）凋亡率低于未携带bcl-2慢病毒的PC-12细胞组（B组）（P＜0.05）。bcl-2基因表达蛋白浓度测定显示，A组高于B组（P＜0.05），说明bcl-2基因对正常PC12细胞的凋亡有抑制作用，能延长PC12细胞的寿命。C组（bcl-2-PC12+H2O2）细胞凋亡率低于D组（NC-PC12+H2O2）（P＜0.05），bcl-2基因表达蛋白浓度高于D组（P＜0.05），证明bcl-2基因能够增强PC12细胞的抗损伤能力。尽管有大量的研究证明bcl-2基因有抗细胞凋亡作用，能够增强细胞对抗损伤的能力，但bcl-2基因转染至细胞内，有可能导致细胞无限制生长，使机体罹患癌症。

［1］Blits B，BungeMB.Directgene therapy for repair of the spinal cord［J］.JNeurotrauma，2006，5（3-4）:508-520.

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［3］Seki T，Hida K，TadaM，etal.Role of the Bcl-2 gene after contusive spinal cord injury in mice［J］.Neurosurgery，2003，53（1）:192-198.

［4］Kumar A，Singh TD，Singh SK，etal.Methods，potentials，and limitations of gene delivery to regenerate central nervoussystem cells［J］.Biologics，2009，3（2）:245-256..

［5］Chen DF，Schneider GE，Martinou JC，et al.Bcl-2 promotes regeneration of severed axons inmammalian CNS［J］. Nature，1997，385（6615）:434-439.

［6］Takahashi K，Schwarz E，Ljubetic C，et al.DNA plasmid that codes for human Bcl-2 gene preserves axotomized Clarke’s nucleus neurons and reduces atrophy after spinal cord hemisection in adult rats［J］.JComp Neurol，1999，404（2）：159-171.

［7］Shimazaki K，Urabe M，Monahan J，etal.Adeno-associated virus vector-mediated Bcl-2 gene transfer into post-ischemic gerbil brain in vivo:prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronaldeath［J］.Gene Ther，2000，7（14）：1244-1249.

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［9］Yamashita S，Mita S，Kato S，et al.Bcl-2 expression using retrograde transport of adenoviral vectors inhibits cytochrome c-release and caspase-1 activation in motor neurons ofmutant superoxide dismutase 1（G93A）transgenic mice［J］.Neurosci Lett，2003，350（1）：17-20.

［10］Yukawa Y，Lou J，Fukui N，et al.Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo［J］.JNeurotrauma，2002，19（8）：1091.

Inhibiting Role of Bcl-2 Gene in the Apoptosis of Nerve Cells

HAN Guihe，WEIWei，GU Jun，et al. Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou(310003)，China

Objective:To observe the inhibiting role of the proto-oncogene bcl-2 in the apoptosis of nerve cells. M ethods:PC12 cells were cultured to the logarithmic growth phase and then slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene and slow virus plasmid infected PC12 cells by 100 multiplicity of infection,respectively.The PC12 cells infected were then divided into 4 groups.Group A：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene；group B：PC12 cells with slow virus plasmid；group C：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene，which were damaged by H2O2；group D：PC12 cells with slow virus plasmid，which were damaged by H2O2.The rate of apoptosis was detected by flow cytometry.The proteinum concentration of bcl-2 gene expression was detected by using bicinchoninic acid method.Results:The apoptosis rate of group A was lower than that of group B and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group A was higher than that of group B，both of which were significantly different between the 2 groups（P＜0.05）.The apoptosis rate of group C was lower than that of group D and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group C was higher than that of group D，both of which significantly differed between the 2 groups（P＜0.05）.Conclusion:Bcl-2 gene can inhibit apoptosis of normal nerve cells and can enhance resistance ability of nerve cell to be damaged.

bcl-2 gene nerve cells apoptosis

2012-11-19

杭州市科技发展计划（No.20100733Q22）