Hippo-YAP信号通路在人膝骨性关节炎中表达的意义

何正言 梅浩

膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一种常见的关节软骨退变疾病，其主要表现为关节疼痛、晨僵、肿胀和进行性致畸。KOA的病变主要在于软骨的退行性改变，而软骨的退行性改变受各种细胞信号通路及因子的调控，其中Hippo-YAP信号通路是近年来研究的热点。目前的研究表明，Hippo通路的发现源自于1995年果蝇基因突变表型Wts，2002年发现了 Hippo 通路的三个成员:Salvador、YAP 和 Mats［1］。目前的研究证明［2］，Hippo信号通路是一条较为保守的信号通路，另外有研究证明［3］Hippo信号通路可以调节细胞的增殖和凋亡，检索国内外文献均为发现Hippo信号通路在骨关节炎中的研究报道。本文将通过探讨骨关节炎与Hippo信号通路的关系，了解Hippo信号通路在骨关节炎发病中的相关机制，为骨关节炎的早期诊断和病情判断提供临床实验数据，并且为进一步的治疗和预防提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验对象 ①病例选择:所有研究对象均来自2010年2月至2012年8月韶关市第一人民医院骨科。实验组膝关节KOA患者71例，女32，男39例，平均年龄(67±12)岁(43～79岁)，以上所有患者均经过临床及关节镜确诊，并且符合1991年美国风湿协会制定的Altman诊断标准。对照组为我院健康体检者29例，无KOA病史，膝关节透视检查正常，女13例，男16例，平均年龄(45±26)岁(26～78岁)。所有试验对象均在行关节镜检查前行关节穿刺，并与其签署知情同意书。②实验标本:两组的滑液均在行膝关节腔穿刺时留取，在抽取关节滑液时，先用1 ml的生理盐水冲洗关节腔，待冲洗完全后抽取1.5 ml。留取的关节滑液标本均离心后取上清，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2 材料和方法 ①主要仪器:普通冰箱(中国海尔)，HHW电热恒温水浴箱(金坛市医疗器械厂)，ELX800酶标分析仪(美国Bio-Tec公司)。②主要试剂:Hippo-YAP抗体试剂盒购自Abcam公司，编号:ab124474。抑制凋亡蛋白BCL-2抗体试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司，编号:BY-5134R。③ELISA试验方法:将96孔板最上面一排的8孔作为标准孔，反复对倍稀释各孔，最后一个孔作为空白孔，建立标准曲线;加入待测样品100 μl，37℃反应90 min;0.01 m PBS洗板三次，滤纸印干;加入 Hippo-YAP-1(BCL-2)一抗 100 μl，37℃反应60 min;0.01 m PBS洗板三次，每次浸泡三分钟，滤纸印干;加入酶标液100 μl，37℃反应 30 min;0.01 m PBS 洗板五次，每次浸泡两分钟，滤纸印干;加入底物 TMB90 μl，置37℃暗处反应5～10 min;每孔加入一滴终止液混匀，当蓝色转为黄色时上机检测;酶标仪设定450nm处测定吸光值。

1.3 统计学方法 所有数据均输入计算机，用SPSS 19.0版本软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，以P＜0.05确定为差异有统计学意义。

2 结果

实验组与对照组的滑液中YAP与BCL-2的表达水平作单因素方差分析，结果见表1。YAP的实验组与对照组比较有统计学意义P＜0.01，KOA患者的滑液中YAP的水平显著高于对照组。BCL-2的实验组与对照组比较有统计学意义P＜0.01，KOA患者的滑液中BCL-2的水平显著低于对照组。

实验组中YAP与BCL-2水平作Spearman相关分析，相关系数为r=0.921(P＜0.01)，两者呈正相关。

表1 关节滑液中PD-1及NO检测结果()

表1 关节滑液中PD-1及NO检测结果()

注:*与对照组比较有统计学意义(P＜0.01)

组别 例数 YAP(pg/ml) BCL-2(pg/ml)实验组 71 42.18±133.54* 33.13±19.21*对照组29 254.12±28.12 194.11±21.61

3 讨论

膝骨关节炎在中老年人疾病中较为常见，其发病原因与关节软骨细胞的退变、凋亡有关，软骨细胞在骨关节炎的发病过程中的变化受内环境中各种细胞信号通路及细胞因子的影响。骨关节炎的病理生理变化主要表现为关节软骨组织的合成与分解代谢失衡，如软骨细胞过度成熟而导致骨赘的形成、关节间隙变小，另一方面软骨细胞破坏过多、退化及萎缩而致关节滑液少、软骨弹性低及关节僵硬［4］。本文以下将对滑液中检测到的Hippo-YAP与BCL-2表达水平在KOA中的可能机制及它们的相关关系展开讨论。

3.1 Hippo-YAP与KOA的关系 Hippo-YAP信号通路是一条较为保守的信号转导通路，其中YAP蛋白是衔接Hippo信号通路上下游因子的重要蛋白，YAP主要是负责从细胞膜到细胞核的信号传导［5］。有研究表明在肿瘤细胞中抑制Hippo信号通路可以使得肿瘤细胞过度增殖分化，并且其中检测到Yki蛋白高表达，而在正常细胞中抑制Hippo信号通路可使得细胞增殖缓慢，说明Hippo信号通路对细胞增殖起正调控的作用，而对肿瘤细胞起筛选的抑制作用［6］。YAP是Hippo通路的主要效应因子，近年来的研究表明YAP对细胞起促进增殖分化的作用［7］。本实验研究中我们发现实验组KOA患者膝关节滑液较对照组显著高表达YAP蛋白，提示了KOA的发病过程中YAP高表达，其可能是病程中YAP介导了软骨细胞凋亡，促进细胞程序性死亡，文献中表明Hippo通路的YAP蛋白与细胞的增殖呈正相关［8］，而本研究中实验组的较老的两例患者的 YAP较低(79岁 =60.73 pg/ml，77岁 =61.11 pg/ml)，其可能是原因是骨关节炎早期时软骨细胞主要表现过度成熟、增生及骨赘的形成，而晚期时表现为软骨退化、萎缩。KOA患者的滑液中BCL-2的水平显著低于对照组，而在正常人中表达较高，其可能的原因是BCL-2在凋亡与抗凋亡平衡中起抗凋亡作用，与文献相符［9］。

3.2 Hippo-YAP信号通路与凋亡的关系 Hippo-YAP信号通路主要通过接受细胞膜上FAT4膜蛋白受体上的信号，从而通过各种膜蛋白传导给YAP，YAP进而将抗凋亡信号转导给细胞核，而细胞核指导各种抗凋亡因子的作用，如BCL-2、AKT、caspase-3等［10］。本研究的结果表明，KOA 患者的滑液中BCL-2的浓度显著低于对照组，提示了KOA的发病过程中关节滑液BCL-2浓度显著降低。KOA患者滑液里YAP与BCL-2呈正相关，近年来的研究证明BCL-2为抗凋亡因子之一，本研究发现YAP与BCL-2呈正相关关系，进一步说明了YAP蛋白可能为抗凋亡因子，因此YAP可能是KOA发病过程中促进关节软骨凋亡的重要因子。

3.3 展望 本实验因为晚期样本量的限制未将实验组的早中期和晚期的患者进行分组研究，而进一步的实验可对形成骨赘的骨关节炎和软骨退变的骨关节炎进行分组研究Hippo-YAP信号通路，其可进一步的研究骨关节炎发病中Hippo-YAP信号通路的机制。综上所述，Hippo-YAP信号通路可能是软骨细胞的抗凋亡过程，深入探讨Hippo-YAP信号通路在骨关节炎中的各种促进机制将有可能建立骨关节炎新的治疗靶点。

［1］Zhao B，Lei QY，Guan KL.The Hippo-YAP pathway:new connections between regulation of organ size and cancer.Curr Opin Cell Biol，2008，20(6):638-646.

［2］Tsai BP，Hoverter NP，Waterman ML.Blending Hippo and WNT:SharingMessengers andRegulation.Cell， 2012，151(7):1401-1403.

［3］Tumaneng K，Schlegelmilch K，Russell RC，et al.YAP mediates crosstalk between the Hippo and PI(3)K-TOR pathways by suppressing PTEN via miR-29.Nat Cell Biol，2012，14(12):1322-1329.

［4］Kutzner I，Heinlein B，Graichen F，et al.Loading of the knee joint during ergometer cycling:telemetric in vivo data.J Orthop Sports Phys Ther，2012，42(12):1032-1038.

［5］Yu FX，Mo JS，Guan KL.Upstream regulators of the Hippo pathway.Cell Cycle，2012，11(22):4097-4098.

［6］George NM，Day CE，Boerner BP，et al.Hippo signaling regulates pancreas development through inactivation of Yap.Mol Cell Biol，2012，32(24):5116-5128.

［7］Tremblay AM，Camargo FD.Hippo signaling in mammalian stem cells.Semin Cell Dev Biol，2012，23(7):818-826.

［8］Konsavage WM Jr，Yochum GS.Intersection of Hippo/YAP and Wnt/β-catenin signaling pathways.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2013，45(2):71-79.

［9］Scatizzi JC，Hutcheson J，Pope RM，et al.Bim-Bcl-2 homology 3 mimetic therapy is effective at suppressing inflammatory arthritis through the activation of myeloid cell apoptosis.Arthritis Rheum，2010，62(2):441-451.

［10］Kammouni W，Wong K，Ma G，et al.Regulation of apoptosis in fibroblast-like synoviocytes by the hypoxia-induced Bcl-2 family member Bcl-2/adenovirus E1B 19-kd protein-interacting protein 3.Arthritis Rheum，2007，56(9):2854-2863.