地佐辛在雌激素干扰下对切口痛大鼠痛行为学及脊髓c-fos蛋白表达的影响

陈江 程桥

随着人们对疼痛研究的不断深入，阿片类药物也愈加受到关注，在对阿片类药物镇痛效果的大量研究中发现疼痛存在显著性别差异，即女性的痛阈和对疼痛的耐受性明显高于男性［1］。其中吗啡类止痛剂以及纳布啡、喷他佐辛等阿片物质的激动剂/拮抗剂的镇痛效果存在两性差异［2］。地佐辛是一种新型的阿片类药物，其镇痛效果是否存在性别差异目前备受争议。Fos蛋白作为一种疼痛在分子水平的标志，可作为神经元兴奋的标志。本实验通过注射外源性雌激素，观察地佐辛在雌激素干扰下对切口痛大鼠行为及脊髓c-fos蛋白表达的影响，探讨雌激素对地佐辛镇痛效果的影响。

1 资料与方法

1.1 主要药物和试剂 17-β雌二醇购自上海博蕴生物公司，地佐辛购自扬子江药业集团有限公司。大鼠C-fos ELISA试剂盒购于上海西塘生物科技有限公司。

1.2 实验分组及给药方法 健康成年雌性SD大鼠32只，重量250～280 g，由山西医科大学实验动物中心提供。将32只大鼠分为去卵巢手术组（OVX+V）、雌激素组（OVX+E）、地佐辛组（OVX+D）和雌激素+地佐辛组（OVX+E+D），各8只。雌激素组于造模前3 h皮下注射17 β-雌二醇（0.2 mg/100 g），地佐辛组于造模后尾静脉注射地佐辛（0.1 mg/100 g）；雌激素+地佐辛组按相应的剂量以及时间点分别给予雌激素和地佐辛。

1.3 卵巢切除术 0.3%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，腹正中切口(1～1.5 cm)，沿子宫找到双侧卵巢并结扎摘除止血，术后连续3 d肌内注射抗生素。在安静、温暖和避强光的环境中饲养4周。

1.4 切口痛模型的制备 大鼠于实验前放置在安静、温暖和避强光的环境中饲养，将大鼠麻醉后，消毒大鼠的左侧后爪，用Brennan等［3］法从足底近端0.5 cm处向趾部做1 cm长的条状切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，保持其起止附着点的完整，纱布按压止血后，用细线缝合皮肤。手术过程持续约5 min。

1.5 行为学观察及评分 行为学改变主要发生在伤害性刺激后1 h，术后1 h观察大鼠行为学改变，观察其左侧后爪及其负重情况。后爪着地且能够负重计0分，后爪着地不负重计1分，后爪翘起不着地计2分。5 min观察1次，每次1 min，以1 min内最常采用的姿势为标准进行评分，共观察1 h(0～24分)。以术侧足评分减去对侧足评分即为所得累积疼痛评分。

1.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测脊髓fos蛋白表达情况 手术刺激后2 h，取每只大鼠腰段脊髓，大鼠的下肢神经相对应的脊髓节段为腰膨大，大致包括腰髓的4～6节段，相应的位置为平胸13肋向下1 cm的范围，即按此范围取材，具体方法如下：（1）腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，大鼠取俯卧位固定；（2）背部正中切口剪开大鼠皮肤，分开筋膜和肌肉，暴露胸椎和腰椎；（3）于13浮肋水平向下1.5 cm咬开相应部位的棘突和椎板，充分暴露脊髓；（4）平13肋向下剪取长度约1 cm的脊髓组织；（5）将所取得脊髓组织称重后置于匀浆缓冲液中匀浆，20000 r/min，离心30 min，取上清液待用，样本在-70℃保存。按照试剂盒说明进行ELISA法检测fos蛋白含量，计算脊髓组织中fos蛋白的浓度。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行处理，所得数据均以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 累计疼痛评分 手术组大鼠均表现术侧后爪翘起，偶尔着地但不负重等疼痛行为。与手术组比较，雌激素组、地佐辛组、地佐辛+雌激素组疼痛均明显减轻（P＜0.05）；与雌激素组比较，雌激素+地佐辛组疼痛也明显缓解（P＜0.05）；与地佐辛组比较，雌激素+地佐辛累计疼痛评分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 四组大鼠疼痛累计评分的表达变化

2.2 脊髓c-fos蛋白表达 与手术组比较，地佐辛组，雌激素组，地佐辛+雌激素组c-fos表达量均明显下降（P＜0.05）；与雌激素组比较，地佐辛+雌激素组c-fos表达量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与地佐辛组比较，地佐辛+雌激素组c-fos表达量变化差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 四组大鼠脊髓c-fos蛋白的表达变化（pg/mL）

3 讨论

Fos蛋白是原癌基因c-fos的表达产物，c-fos基因是一种即刻早期基因，正常情况下，在细胞内很少表达，当机体受到伤害性刺激时后能够在中枢神经系统内不同部位表达，因此c-fos可作为神经元兴奋的标志，是研究中枢神经系统最具有代表性的即刻早期基因［4］。雌激素主要通过雌激素受体来发挥作用，雌激素受体(estrogen receptors，ERs)是甾体激素受体，其广泛分布于生殖系统、免疫系统、骨骼系统和心血管系统。目前神经解剖学研究显示，ERs广泛分布于痛觉传递和调制通路中，如背根神经节、脊髓背角、中脑导水管周围灰质、臂旁核、脊核、下丘脑、大脑边缘系和几个皮质区等区域，并通过激活不同部位的雌激素受体参与痛觉的广泛调节［5］。本实验中我们采用Fos蛋白作为疼痛刺激的标志物，发现去卵巢大鼠给予外源性雌激素后，疼痛评分降低，c-fos表达明显减少，再次证实雌激素可以降低或逆转卵巢切除大鼠的增加的疼痛敏感性，起到抗疼痛过敏作用。

地佐辛是一种新型的阿片类药物，为阿片受体混合激动-拮抗剂，为κ受体激动剂、 受体拮抗剂［6］，其安全性高，不良反应少，镇痛满意率高于吗啡，实验结果发现去卵巢大鼠和雌激素组大鼠在给予地佐辛后，疼痛评分和c-fos表达量均明显下降，这和以前的研究结果一致，表明地佐辛确实可以发挥明显的镇痛作用，但是地佐辛联合雌激素组和单用地佐辛组比较，疼痛评分和c-fos表达量变化均不明显，其具体原因可能为：地佐辛为阿片受体混合激动-拮抗剂，而雌激素也能够双向影响阿片系统，首先雌激素可以通过减少L-精氨酸/NO/cGMP通路来下调κ阿片受体数量或功能，从而减弱TMJκ调节的镇痛。其可能通过降低κ阿片受体mRNA的合成或者增加这些纤维的κ阿片受体mRNA降解来下调功能性阿片受体的数量，也可能通过增加GRKs的mRNA的转录，激活GRK/抑制蛋白系统从而导致κ阿片受体脱敏，减弱阿片受体的功能［7］。其次，有研究显示雌激素可增加疼痛诱导的μ阿片受体在大脑中的结合，增加μ阿片受体的有效性，这表明外源性雌激素可增强内源性阿片系统的功能。雌二醇治疗可能增加大鼠海马和丘脑μ结合位点的数目；同时雌激素还可导致中央视前区核和后背角中央杏仁核的μ阿片受体的内化，这种内化被认为是突触活性的标志；并雌激素还可作用于阿片受体突触前神经元，从而增加内源性阿片肽的释放，从而降低大鼠疼痛敏感性。大量研究还表明，在外周初级传入伤害性感受器上，μ阿片受体、κ阿片受体和GIRK通道是共表达的，雌激素可以通过调控GIRK 2参与对阿片镇痛的调节，但其具体机制目前尚不清楚［8］。

综上所述，雌激素对阿片受体存在双向调节作用，不仅可以下调κ阿片受体数量或功能，还可以增加μ结合位点的数目，而地佐辛为阿片受体混合激动-拮抗剂，地佐辛与雌激素联合用于去卵巢大鼠，两者对阿片受体的这种作用可能会通过多种通路相互影响，部分抵消，相互中和，最终在我们的结果中看到地佐辛的镇痛效果并没有受到雌激素的太多干扰。但是具体机制可能受到多重因素的影响包括药物本身的特殊性，如剂量、药理作用、给药途径和给药时间等，还有物种、基因型、年龄和性激素周期等。

我们的结果表明，基于本实验条件下，雌激素单独应用对c-fos表达有一定程度抑制作用，但雌激素对地佐辛的镇痛效果没有明显的影响。

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［7］Clemente-Napimoga JT,Pellegrini-da-Silva A,Ferreira VH,et al.Gonadal hormones decrease temporomandibular joint kappa-mediated antinociception through a down-regulation in the expression of kappa opioid receptors in the trigeminal ganglia［J］. EurJ Pharmacol，2009，617(1-3):41-47.

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