荧光PCR及培养法检测解脲支原体结果对比分析

潘春燕 蔡朝民 谢春英 王燮衡

解脲支原体（Ureaplasma Urealyticum,UU）是条件致病菌，当机体免疫力下降、菌群失调、长期使用抗生素时能迅速繁殖，其黏附在泌尿道上皮细胞表面[1-2]。UU常引起非淋菌性阴道炎，UU感染还可导致不育、早产、慢性前列腺炎等[3]。临床对UU的确诊主要依靠实验诊断，实验室对UU的检查方法主要有荧光PCR、培养、酶链免疫试验等。荧光PCR技术采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对UU核酸的自动化检测。培养法不需要特殊设备，操作简单，同时还可以做药敏试验，目前临床上普遍使用此法来检测解脲支原体。随着分子生物学的发展，荧光PCR技术在检测病原体方面得到越来越广泛的应用。本文通过收集856 例样本，分别采用荧光PCR和培养法检测解脲支原体，对检测结果进行分析比较，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 856 例患者均为2010年1月-2012年1月广东省深圳市宝安区人民医院接诊的女性病例，年龄18～57岁。

1.2 试剂 荧光PCR UU检测试剂盒由深圳匹基公司提供，UU液体培养基由珠海银科生物技术应用研究所提供。

1.3 仪器 ABI Gene Amp 7700 荧光PCR扩增仪(美国ABI公司)、高速低温离心机（Sigma公司）、干式恒温器（ 杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱（SANYO公司）、恒温培养箱（上海精宏实验有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 标本的采集 所有患者均用窥阴器暴露宫颈后，先用棉拭子擦去宫颈口过多的黏液，再用另一根棉拭子插入宫颈管内1～2 cm处，停留10～30 s后缓慢旋转1 周，取出分别置于两根无菌试管内待检。

1.4.2 培养方法及结果判定 将待检拭子在取出后半小时内接种于UU培养液中，置于37℃ 5%～10% CO2和90%～95% N2环境中，每天观察结果，培养24～48 h后液体培养基从淡黄色→淡红色→红色，且澄清无明显沉淀者即为UU生长，结果阳性；不变色者为阴性；变红色且浑浊者为细菌污染。

1.4.3 荧光PCR法检测UU DNA

1.4.3.1 UU DNA模板制备 取待测样本及阴、阳性对照品（试剂盒备有）各100 uL,分别加入到0.5 mL的离心管中，再分别加入100 uL DNA提取液1，震荡混匀，13000 rpm离心10 min；吸弃上清液，再加入50 ul提取液2，震荡混匀，100℃干浴10 min；冷至室温后,13000 rpm离心10 min,保留上清液备用。

1.4.3.2 PCR扩增 从试剂盒中取出UU DNA扩增反应液、Taq酶及UNG，室温融化后按规定比例混合均匀，根据试剂盒说明书配制反应液，分装于PCR反应管中，每次实验均设1 管阴性对照，1 管阳性对照，将上述对照及标本各加2 uL于加好反应液的PCR反应管中，上机扩增。扩增条件设置为37℃：5 min； 94℃：1 min；95℃：5 sec； 60℃:30 sec；再进入40 个循环，反映体系设为40 uL。荧光信号收集时设定为Fam荧光素。

1.4.3.3 结果分析条件设定 取3-10 或3-15 个循环的荧光信号，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值=40.0 为准。

1.4.3.4 质控标准 阴性对照的Ct值均应等于40.0，阳性对照的Ct值应小于等于30.0。

1.4.3.5 结果判断 Ct值等于40 或0 的样本为阴性标本；检测样本Ct值≤37.0 者判为阳性；Ct值＞37.0 的样本重做，重做结果Ct值＜40 为阳性，否则为阴性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

荧光PCR法检测856 例样本中的解脲支原体，351 例阳性，阳性率达41.0%，351 例荧光PCR法检测阳性的样本中有67 例培养法检测阴性；培养法检测856 例样本，289 例阳性，阳性率达33.7%，其中5 例培养法检测阳性的样本荧光定量PCR法检测为阴性；两种方法检测均阳性284 例。荧光PCR的阳性检出率明显高于培养法（P<0.05）,结果见表1。对67 例荧光PCR检测阳性而培养法检测阴性病例进行病史及用药史追踪。

表1 荧光PCR和培养法UU检测结果比较

3 讨论

UU是一群大小介于细菌与病毒之间的病原体，临床对UU的确诊主要依靠实验诊断。荧光PCR技术敏感、快速，目前已常规的应用到临床一些病原体的检测中，该技术把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光探针定量PCR技术融为一体，PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭的条件下进行，并通过微机控制，实现了对扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分析[4]。培养法检测UU，主要是利用UU可产生脲素酶分解尿素引起培养基变色的原理，根据指示剂是否变色来判断结果的阴阳性。本文收集了856 例宫颈分泌物样本，分别用荧光PCR技术和培养法检测解脲支原体，对检测结果进行比较分析。

荧光PCR法检测856 例样本，351 例阳性，阳性率达41.0%，351 例荧光PCR法检测阳性样本中67 例培养法检测呈阴性，造成这种差异的原因主要有：（1）荧光PCR技术敏感度比培养法高,荧光PCR是采用体外扩增的方法，理论上只要存在病原体DNA即可检出；（2）标本的采集及标本搁置的时间影响到检测结果，培养法必须有一定存活的病原体存在才可检出，标本搁置时间过长易导致培养法检测结果的假阴性，而荧光PCR法检测则无需活的病原体存在，对死亡一段时间内的病原体DNA仍可检出；（3）污染造成检测结果的假阳性。培养法检测856 例样本，289 例阳性，阳性率达33.7%，其中5 例培养法检测阳性样本荧光定量PCR检测为阴性，出现这种情况的原因我们认为主要有：（1）标本中存在抑制Taq酶的因子；（2）模板提取缺失，未能提取到目的模板；（3）基因变异，UU变异后仍保留其分解尿素的特性，此时培养法检测结果为阳性，而荧光PCR技术中引物设计是针对靶序列基因保守区的，未能检出其变异基因[5]。

从检测结果看，两种方法的阳性检出率有明显差异（P<0.05），荧光PCR的阳性检出率明显高于培养法。我们对67例荧光PCR检测阳性而培养法检测阴性病例进行病史和用药史追踪，发现有27 例患者在初诊确认为UU感染，经药物治疗临床症状已基本消失，此时患者的宫颈分泌物样本用培养法检测为阴性，而荧光PCR检测仍为阳性。我们认为患者支原体感染后的用药监测，采用培养法检测病原体，结果更为客观，这与陈春英等的结论基本一致[6]。对于初诊，且尚未使用药物的患者，以及对UU的流行病学调查研究可采用荧光PCR法，由于荧光PCR检测结果无法反映UU的存活状况，因此不适合用于药物监测。在UU检测的方法学选择上，我们认为可以根据不同目的来选择，结合荧光PCR及培养法，更能提高UU的检测水平。

[1]刘小敏，李海燕，杨美玲，等.泌道生殖道支原体、衣原体及药敏试验检测及药敏结果探讨[J].中外医学研究，2012（12）44-45.

[2]周铁明，刘佩.泌尿生殖道分泌物支原体培养及药敏结果分析[J].国际检验医学杂志，2011,32（3）：410-411.

[3]马新茹.女性泌尿生殖道炎症患者支原体感染现状及其抗生素的敏感性研究[J].实验预防医学，2012（3）:733-734.

[4]Fahle GA，Parker JM，Fischer SH，et al.Rapid and sensitive detection of cytomegalovirus using PCR and the DELFIA-time-resolved fluorescence hybridization assay[J].Abstr Gen Meet AM Soc Microbiol,1997,4(8):153.

[5]陈春英，杨舒盈，朱根海.女性生殖道感染治疗前后解脲支原体荧光定量PCR检测的假阳性分析[J].中国优生与遗传，2007，15（3）：32.

[6]时宇花，韦玉莹.女性泌尿生殖道炎症患者解脲支原体、人型支原体和沙眼衣原体感染检测及药敏分析[J].广西医学，2013，35（2）：229-230.