伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的克隆表达与多克隆抗体的制备

翁晓琴，张红，詹莉芳，张晓磊，生秀梅，徐顺高，黄新祥

(江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 212013)

伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一种人类重要的致病性革兰阴性杆菌，通过食源性传播导致一种全身系统性疾病—伤寒症，这种疾病在不发达地区仍有暴发［1］。细菌可以适应广范围的外环境渗透压变化，其分子机制非常复杂［2］，例如伤寒沙门菌从食物的低渗环境突然进入肠道的高渗环境中，为了抵御高渗应激，许多细胞膜蛋白的表达量会发生变化，特别是那些周质蛋白(periplasmic protein)，如ProU和OsmY 蛋白等［3－4］。

在大肠埃希菌中，osmY基因是一种渗透压诱导基因，其表达依赖于RpoS的激活［5］。在高渗应激的条件下，osmY基因的表达量明显升高8～10倍，能编码一种相对分子质量约22×103的周质蛋白OsmY，有研究者推测OsmY蛋白是运输某种渗透物的载体，但其确切功能至今未知［6］。我们通过基因表达谱分析发现，在高渗应激早期，伤寒沙门菌osmY基因缺陷株与野生株相比，有许多重要功能的基因表达发生变化，其中包括Vi荚膜基因、菌毛基因和侵袭相关基因等［7］。所以我们猜测，在高渗应激的环境下，OsmY蛋白可能作为一个重要蛋白参与调节某些基因的表达，或者与其他相关蛋白相互作用来帮助细菌抵御高渗环境。

本研究拟克隆表达重组蛋白OsmY－His6并制备兔抗重组蛋白的多克隆抗体，为进一步研究OsmY蛋白在高渗应激环境中所发挥的功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 野生型 S.Typhi GIFU 10007由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠;E.coli JM109(DE3)和质粒 pET22b(+)由本室保存。

1.1.2 主要试剂与材料 DNA聚合酶pfu和预染蛋白标准参照物均为Fermentas公司产品;rTaq、缓冲液、dNTP、DL2000、限制性内切酶 NcoⅠ和 XhoⅠ、T4DNA连接酶均为TaKaRa(大连)公司产品;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品;IPTG为Promega公司产品;质粒提取试剂盒为Axygen公司产品。

1.1.3 主要仪器 高速冷冻离心机(Eppendorf)，凝胶成像分析系统和蛋白电泳仪(Bio－Rad)，PCR扩增仪2720 Thermal Cycler(ABI)，核酸检测仪(Nano－Drop)，恒温摇床(Thermo scientific)，JY92－IIDN 超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.4 实验动物 家兔2只(江苏大学实验动物中心)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和目的基因的获取 利用基因库获取伤寒沙门菌osmY基因的核苷酸序列618 bp，通过Oligo 6.0软件设计PCR特异性上下游引物P－osmY－A/B，并分别在引物5'端加接NcoⅠ和XhoⅠ的特异性酶切序列，由上海生工生物技术公司合成，P－osmY－A:

GACCATGGATATGACTATGACAAGACTG(下划线为 NcoⅠ酶切位点)，P－osmY－B:

ATCTCGAGCTGAACTTTCAGATCGTT(下划线为XhoⅠ酶切位点)。从LB平板挑取伤寒沙门菌GIFU 10007菌落，加入1 mL去离子水并振荡混匀，100℃ 煮10 min，离心取上清(含基因组DNA)，以上清为模板，以P－osmY－A/B为引物，用高保真 DNA聚合酶 pfu扩增目的基因osmY。

1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 用酚仿－乙醇法纯化PCR产物，纯化后的PCR产物和表达载体pET22b(+)经NcoⅠ和Xho I双酶切后，酶切产物经酚仿－乙醇法纯化后用T4DNA连接酶4℃连接过夜。将连接产物热激转化入E.coli JM109，从转化平板上挑取24个菌落接种在24等份含氨苄西林的LB平板上增菌培养过夜，将上述菌体和空载体转化菌体收集于30 μL蒸馏水的EP管中，向EP管中再加30 μL 酚/氯仿/异戊醇(25 ∶24 ∶1)混合液，在振荡器上剧烈振荡，离心取10 μL上清，用0.7%琼脂糖凝胶电泳初步筛选含阳性质粒的细菌。提取阳性克隆质粒，用PCR和双酶切验证阳性质粒，再通过DNA测序分析确认阳性质粒的序列正确(测序分析由上海生工生物技术公司完成)。原理见图1。

图1 伤寒沙门菌pET22b(+)-osmY重组质粒的构建原理Fig 1 The schematic diagram of the pET22b(+)-osmY vector of S.Typhi

1.2.3 OsmY蛋白表达条件 挑取分别含重组质粒 pET22b(+)－osmY和空质粒 pET22b(+)的E.coli JM109于1 mL LB培养液中(氨苄西林0.1 mg/mL)，37℃振摇过夜，然后以1∶100的比例转接入20 mL LB培养液中，37℃振摇2～3 h至D(600 nm)为0.5，加入 TPTG 至终浓度为1 mmol/L，于18 ℃振摇诱导 12 h［8］，冰浴 10 min，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，用500 μL PBS缓冲液重悬菌沉淀，250 μL菌液用于全菌蛋白电泳，另外250 μL菌液用于4℃超声至清亮，12 000 r/min离心15 min，取上清和沉淀进行SDS－PAGE电泳。

1.2.4 OsmY蛋白的纯化 用上述诱导条件1 000 mL培养重组表达菌，冰浴 10 min，4℃，10 000 r/min离心10 min后取菌沉淀，并用PBS缓冲液(pH7.2)洗涤3次，将菌沉淀称重，在菌沉淀中加入相应体积的非变性结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪 唑 pH 8.0)(10 mL非变性结合缓冲液/1 g菌)，4℃超声破碎后，4℃ 12 000 r/min离心30 min，收集上清液。用非变性结合缓冲液平衡Ni柱，再将收集的上清液以1 mL/min的速度上样于Ni柱，用非变性洗涤缓冲液 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑 pH 8.0)洗涤杂蛋白，直至紫外分光光度仪检测蛋白质量浓度接近0 μg/mL，此时用非变性洗脱缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑 pH 8.0)洗脱融合蛋白，共收集5 mL，用紫外分光光度仪检测蛋白质量浓度并用SDS－PAGE电泳鉴定纯度。

1.2.5 兔抗 OsmY蛋白多克隆抗体的制备 用PBS缓冲液透析收集的融合蛋白OsmY－His6以去除咪唑，将透析好的融合蛋白OsmY－His6与等体积的弗氏完全佐剂研磨至完全乳化，每只家兔以1 mL乳化的免疫原(含50 μg融合蛋白)，背部皮下多点注射。每隔2周将抗原与等体积的弗氏不完全佐剂研磨至乳化后免疫家兔，共免疫4～5次，末次免疫1周后颈动脉放血并获得抗血清，用半饱和硫酸铵盐析法和透析除盐法获得粗提的多克隆抗体，分装后保存于－20℃［9］。用双向免疫琼脂扩散法测定抗体效价，用蛋白质印迹法检测多克隆抗体与抗原反应的特异性。

2 结果

2.1 伤寒沙门菌 pET22b(+)－osmY重组质粒的构建

以S.Typhi野生株 GIFU 10007为模板，PCR扩增得到约633 bp的DNA片段，经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后与表达载体pET22b(+)相连接，连接产物转化入E.coli JM109，筛选阳性克隆质粒，并提取初筛阳性质粒pET22b(+)－osmY，经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切与PCR鉴定，osmY基因已经成功与表达载体pET22b(+)相连(图2)。

2.2 重组蛋白OsmY－His6的表达与纯化

带有重组质粒 pET22b(+)－osmY的 E.coli JM109在18℃、TPTG终浓度为1 mmol/L的条件下诱导12 h后，经SDS－PAGE电泳鉴定:在超声后上清中可见大量的重组蛋白OsmY－His6，该上清经Ni柱纯化后获得重组蛋白OsmY－His6(图3)。

图2 伤寒沙门菌pET22b(+)-osmY重组质粒的构建Fig 2 Preparation of the pET22b(+)-osmY vector of S.Typhi

图3 重组蛋白OsmY-His6的表达与纯化Fig 3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein OsmY-His6expression and purification

2.3 兔抗OsmY－His6蛋白的多克隆抗体制备

以纯化的OsmY－His6蛋白为免疫原免疫家兔，获得兔抗OsmY－His6的多克隆抗体，用双向免疫琼脂扩散测定效价为1∶8。蛋白质印迹显示多克隆抗体与抗原反应的特异性良好(图4)。

图4 抗体特异性的免疫印迹鉴定Fig 4 Western-blotting analysis of the anti-OsmY polyclonal antibody

3 讨论

伤寒沙门菌(S.Typhi)是沙门菌属中一种重要的人类肠道致病菌，通过污染的食物进入消化道后，侵入空肠M上皮细胞，并能在M细胞中存活和增殖，最终可穿过肠系膜淋巴组织进入淋巴循环和血液循环，从而进入肝、脾和肾等脏器，造成系统性感染［10］。在这个致病过程中，伤寒沙门菌需要克服肠道的高渗环境，其分子机制非常复杂，主要通过两种途径:一是蛋白活性的调节，作为一种立即反应;二是基因转录的调节，作为一种长期反应。细菌必需产生许多化学分子将环境外部的刺激信号转导入细胞内部，从而来实现这两种途径［11］。

大肠埃希菌在高渗应激的条件下，周质空间中的某些蛋白的表达量增多，如ProU和OsmY蛋白等［3－4］。周质空间又称壁膜空间，位于细胞壁与细胞膜之间的狭窄间隙，含有多种蛋白质，例如蛋白酶、核酸酶等各种水解酶和运送某些物质进入细胞内的结合蛋白，以及趋化性的受体蛋白等。osmY基因是一种渗透压诱导基因，在高渗应激的条件下，其表达量明显升高8～10倍，能编码相对分子质量约为22×103的周质蛋白OsmY。所以有研究者推测OsmY蛋白是运输某种渗透物的结合蛋白，但其确切功能至今未知［6］。我们的前期实验发现，与伤寒沙门菌野生株相比，osmY基因缺陷株在高渗应激早期，有许多基因的表达量发生显著变化，有表达量上调的基因(tviA、fimA、treC等)和表达量下调的基因(otsB、fimA、rpoS 等)［7］。据此，我们猜测 OsmY 蛋白在高渗应激的条件下可能有3种作用，一是作为调节蛋白来调节某些基因的表达;二是与其他相关蛋白相互作用来调节蛋白活性;三是作为结合蛋白来运输某种渗透物。

本研究克隆表达了重组蛋白OsmY－His6并制备兔抗重组蛋白的多克隆抗体，为进一步研究OsmY蛋白在高渗应激环境中所发挥的功能提供了基础。

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