α-硫辛酸对高糖环境下心肌成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路的影响

王国贤，刘珊珊，李飞，李兆刚，李瑞芳

(辽宁医学院药理教研室，辽宁 锦州 121001)

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是最强有力的致心肌纤维化的细胞因子，正常心脏中TGF-β1含量很低，糖尿病患者在高血糖、氧化应激、炎症等众多因素的刺激下，体内 TGF-β1表达上调，其通过胞内信号分子Smads蛋白转导信号，调控细胞胶原等效应基因表达，诱导心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFb)向肌成纤维细胞分化，刺激胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖等的合成［1－2］。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，α-LA)作为一种强抗氧化剂，能消除氧自由基和超氧基的活性，阻止机体的氧化作用，保护机体细胞。大量研究表明，α-硫辛酸对糖尿病及其并发症有治疗作用，其抗氧化作用已经得到证实［3］。本研究着重探讨α-硫辛酸能否影响高糖环境下心肌成纤维细胞TGF-β1/Smads信号传导途径的表达，进而影响CFb增殖和胶原合成，以进一步探讨这类药物抗心肌纤维化的心脏保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生2～3 d的清洁级SD乳鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2003-0007。

1.1.2 药品与试剂 α-硫辛酸纯品由上海现代浦东药厂有限公司提供，溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，DMSO在细胞培养液中的终体积浓度为0.1%(V/V)。DMEM培养基、血清购自美国Gibco BRL公司;波形蛋白单克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒购自博士德公司;MTT试剂购自Sigma公司;ELISAⅠ型胶原试剂盒购自北京博奥森公司。兔抗大鼠TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7和β-肌动蛋白一抗购于Cell Signaling公司，山羊抗兔IgG二抗由辽宁医学院科学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 CFb的培养和鉴定 无菌条件下开胸，迅速取出心脏，用眼科剪将组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，加入0.08%胰蛋白酶于37℃水浴并在磁力搅拌器上(速率100 r/min)消化细胞，将收集的上清液离心3次，1 000 r/min，10 min，将所得全部细胞置于含10%胎牛血清DMEM培养液的培养瓶中，在37℃，5%CO2培养箱中，采用90 min差速贴壁法去除心肌细胞。待CFb生长接近融合时以1∶2传代。实验采用2～4代CFb。

在倒置显微镜下观察CFb形态;按免疫组化试剂盒说明书，采用SABC法鉴定，所培养的细胞抗波形蛋白抗体阳性、抗α-肌动蛋白单克隆抗体染色阴性，符合成纤维细胞的染色特征，纯度达95%以上。

1.2.2 实验分组和给药 细胞培养24 h后换无血清培养液饥饿24 h，按不同处理分组:正常糖组(加入葡萄糖5.5 mmol/L)，高糖组(加入葡萄糖25.5 mmol/L)，α-硫辛酸干预组:高糖 +不同浓度α-硫辛酸(100、200、300 μmol/L)。根据预实验确定的刺激浓度，剂量 ＞300 μmol/L后细胞成活率＜95%。

1.2.3 噻唑蓝四氮唑(MTT)比色法检测CFb增殖取对数生长期CFb，0.08%胰蛋白酶消化细胞后，用10%FBS-DMEM培养液调整细胞密度为5×104/mL，接种于 96孔培养板，每孔 200 μL。37℃、5%CO2培养24 h贴壁后，换用无血清的DMEM培养液，继续培养24 h，使CFb处于同步生长休止期。给予α-硫辛酸干预后，再培养48 h，每孔加入15 μL MTT(5 mg/mL)，37℃继续培养4 h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100 μL DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上492 nm处测定各孔的光密度(D)值。

1.2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测胶原含量细胞37℃、5%CO2培养24 h后，换用无血清的DMEM培养液，继续培养24 h，使CFb处于同步生长休止期。收集培养液上清，并离心。采用双抗体两步夹心ELISA测定CFb中胶原Ⅰ的含量，每组实验设定6个复孔，以空白孔调零，用450 nm波长测量各孔的D值，按照说明书步骤进行操作。

1.2.5 蛋白质印迹检测TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白含量 37℃、5%CO2培养24 h贴壁后，换用无血清的DMEM培养液，继续培养24 h，使CFb处于同步生长休止期，给予不同浓度的α-硫辛酸刺激48 h后，收集细胞，提取总蛋白并测蛋白浓度。将20 μg蛋白样加入10%的SDS-PAGE凝胶孔中，电泳，转膜，封闭，洗膜，加入1∶1 000稀释的兔抗大鼠 β-肌动蛋白、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7进行杂交，4℃过夜，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG杂交，通过ECL化学发光法，将蛋白条带显现于 X胶片上，显影条带经1200Pro型图像扫描仪扫描，CAMIAS008图像分析系统处理。

1.2.6 统计学方法 采用 SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用 LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFb 鉴定

倒置显微镜下观察，培养出的CFb呈梭形或不规则的三角形，胞体较大，胞质淡而几乎透明，中央有卵圆核，胞质向外伸出突起，细胞排列呈放射状，无搏动。生长至汇合状态时发生接触抑制，密集时可形成编织状外观。免疫组织化学染色结果可见细胞中波形蛋白染色呈阳性反应，肌动蛋白免疫组化染色呈阴性反应(细胞质内出现棕黄色颗粒样物质的比例小于10%)。见图1。取5个高倍视野，计数100个细胞中波形蛋白染色阳性细胞所占比例达95%以上。

2.2 α-硫辛酸对高糖环境下CFb增殖的影响

在高糖环境下，细胞给予不同浓度α-硫辛酸刺激24 h后，采用MTT法检测CFb增殖程度。结果表明，与正常糖组比较，高糖组D值显著提高(P＜0.01)。加入不同浓度α-硫辛酸后，D值明显低于高糖组，且呈浓度依赖性。见表1。

图1 免疫组化染色鉴定CFb(SABC×400)Fig 1 Immunohistochemical study appraisal CFb(SABC×400)

2.3 α-硫辛酸对高糖环境下CFb中Ⅰ型胶原生成的影响

给予不同浓度的α-硫辛酸刺激24 h后，采用ELISA方法检测各组细胞Ⅰ型胶原生成水平。实验显示，与正常糖组相比，高糖组中Ⅰ型胶原的表达量明显增加(P＜0.01);加入不同浓度α-硫辛酸后，Ⅰ型胶原的生成水平均明显低于高糖组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且呈浓度依赖性，见表1。

表1 α-硫辛酸对高糖环境下CFb增殖及胶原合成的影响 ，n=6Tab 1 Effect of alpha lipoic acid on CFb proliferation and collagen synthesis in high sugar impact

表1 α-硫辛酸对高糖环境下CFb增殖及胶原合成的影响 ，n=6Tab 1 Effect of alpha lipoic acid on CFb proliferation and collagen synthesis in high sugar impact

与正常糖组比较，a:P ＜0.01;与高糖组比较，b:P ＜0.05;与100 μmol/L 比较，c:P ＜0.05;与 200 μmol/L 比较，d:P ＜0.05

组别 MTT-D值 胶原Ⅰ/μg·mL －1正常糖组0.000 0.000 0.301 4 ±0.025 1 3.21 ±0.67高糖组 0.489 6 ±0.031 5a 7.45 ±1.12a α-硫辛酸干预组100 μmol/L 0.459 0 ±0.031 6b 6.53 ±1.20b 200 μmol/L 0.407 1 ±0.024 3b，c 4.67 ±1.14b，c 300 μmol/L 0.337 4 ±0.013 1b，d 4.03 ±0.78b，d F 值 44.652 67.682 P值

2.4 α-硫辛酸对CFb中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响

蛋白质印迹结果显示，与正常糖组比较，高糖组心肌成纤维细胞中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3 蛋白表达增加，Smad7蛋白表达减少，P均＜0.01;用不同浓度 α-硫辛酸作用 24 h后，细胞中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3蛋白表达显著降低，Smad7蛋白表达升高。见表2、图2。

表2 α-硫辛酸对CFb中 TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响，n=6Tab 2 Effect of alpha lipoic acid on protein expression of TGF-β，p-Smad2/3，Smad2/3，Smad7 in the CFb

表2 α-硫辛酸对CFb中 TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响，n=6Tab 2 Effect of alpha lipoic acid on protein expression of TGF-β，p-Smad2/3，Smad2/3，Smad7 in the CFb

与正常糖组比较，a:P ＜0.01;与高糖组比较，b:P ＜0.05;与100 μmol/L 比较，c:P ＜0.05;与 200 μmol/L 比较，d:P ＜0.05

Smad2/3 p-Smad2/3 Smad7正常糖组 0.48 ±0.036 0.46 ±0.023 0.29 ±0.032 0.56 ±0.024组别 TGF-β1高糖组 0.87 ±0.051a 0.76 ±0.034a 0.81 ±0.043a 0.31 ±0.032a α-硫辛酸干预组100 μmol/L 0.81 ±0.034b 0.68 ±0.022b 0.64 ±0.038b 0.36 ±0.043b 200 μmol/L 0.68 ±0.044b，c 0.66 ±0.035b，c 0.52 ±0.021b，c 0.40 ±0.025b，c 300 μmol/L 0.56 ±0.036b，d 0.61 ± 0.043b，d 0.46 ±0.31b，d 0.47 ±0.052b，d F 值 43.184 56.256 62.142 45.154 P值0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

心肌纤维化又称心脏胶原网络重构，其核心环节是胶原合成增多而降解减少，造成胶原成分在心肌间质过度沉积［4］。心肌间质网络主要是由 I型和Ⅲ型胶原纤维组成，其中I型胶原蛋白占总量的80%以上，糖尿病心肌病时，心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增多，各型胶原比例失调、排列紊乱，使心肌纤维增粗，心肌供血障碍，心肌僵硬度增加，心室顺应性下降，最终致心室收缩及舒张功能不全［5］。CFb是诱发心肌间质纤维化的主要细胞，约占心脏非心肌细胞90% ～95%，Ⅰ、Ⅲ型胶原主要由CFb合成分泌，因此它对维持心脏的结构和功能起着不可忽视的作用［6］。

TGF-β1是最强有力的致心肌纤维化的细胞因子，在糖尿病患者中，高血糖诱导的氧化应激可上调TGF-β1表达，进一步诱导CFb增殖，促进胶原合成，抑制胶原降解，加剧心肌纤维化的发生和发展［7］。本研究结果显示，高糖组心肌成纤维细胞TGF-β1蛋白表达水平显著高于正常糖组，说明糖尿病心肌纤维化可能与TGF-β1过度表达有关。经不同浓度α-硫辛酸干预后 TGF-β1表达显著减少，说明 α-硫辛酸可降低糖尿病心肌病中 TGF-β1的表达，从而缓解糖尿病心肌病的发生与发展。

Smad蛋白是作为TGF-β1家族的下游信号分子，是 TGF-β1唯一的底物。有研究显示，糖尿病心肌病大鼠心脏Smad3表达明显增加，而 Smad7表达减少，提示 TGF-β1可能参与了心肌纤维化的形成，并且与 Smad3和 Smad7表达失衡有关［8］。在多种相关因素的刺激下，TGF-β1首先与细胞膜上的TGF-β受体Ⅱ结合，活化后的TGF-β受体I直接磷酸化Smad2和Smad3，并与Smad4形成异源寡聚体复合物，Smad复合物随即转移到细胞核内与特异的DNA结合蛋白结合，调节相应靶基因转录［9］。其中，Smad7为抑制性 Smads蛋白(I-Smads)，被认为是TGF-β1信号转导通路上最重要的负性调节因子之一，可与 Smad2、Smad3 竞争性结合 TGF-β1，阻止Smad2、Smad3磷酸化而阻断 TGF-β1信号向下传导［10－11］。实验结果显示，与正常糖组相比，高糖组中p-Smad 2/3蛋白表达增高，而Smad 7蛋白表达减低，提示Smad2/3可能参与了糖尿病心肌病心肌纤维化的发生发展过程，而Smad7通过对 TGF-β1信号转导通路的负反馈调节，使TGF-β1表达减少，从而起到对糖尿病心肌病的保护作用。α-硫辛酸作为一种强抗氧化剂，可清除活性氧自由基，再生谷胱甘肽，广泛用于治疗多种和氧化应激相关的疾病，它在改善糖尿病血管并发症方面的作用备受关注［12］。实验显示，经不同浓度α-硫辛酸干预后，CFb增殖及Ⅰ型胶原含量显著降低，Smad7蛋白表达明显上调，p-Smad 2/3、Smad 2/3表达下调，且有浓度依赖趋势，表明α-硫辛酸可影响 TGF-β1的细胞内信号转导，通过下调 TGF-β1、p-Smad 2/3、mad 2/3 表达、上调 Smad7表达，抑制CFb增殖及胶原生成，减轻心肌纤维化，进而对糖尿病时心肌组织起到保护作用。

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