BARF1基因对鼻咽癌细胞NF-κB信号通路及bcl-2基因表达的影响

徐美琴，李友琼，张雪怡，褚福营，张宇琼，陈巧林，成静，周天戟

(1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013;2.广西壮族自治区人民医院检验科，广西南宁530022)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科，1964年首次从非洲儿童的Burkitt淋巴瘤细胞中发现。研究表明，EB病毒是一种致瘤性病毒，与多种恶性肿瘤密切相关，如Burkitt淋巴瘤、免疫缺陷患者的机会性淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等［1-2］。其中鼻咽癌是一种恶性度极高的人类肿瘤，EB病毒感染率达100%，EB病毒在其发生中起重要作用［2-3］。BARF1是EB病毒编码的癌基因，在大多数鼻咽癌组织中都能检测到［1，3］，但其所起作用及机制尚不清楚。研究发现，BARF1能够抑制上皮细胞的凋亡［4-6］，而细胞凋亡紊乱与肿瘤的发生发展具有非常密切的关系。核转录因子-κB(NF-κB)信号通路在细胞凋亡调控中扮演重要角色［7-10］，而bcl-2是 NF-κB的重要靶基因，是细胞凋亡过程中的重要调节基因之一。本研究旨在探讨BARF1对鼻咽癌细胞NF-κB信号通路活性及bcl-2基因表达的影响，以阐明BARF1抑制上皮细胞凋亡的机制。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

人鼻咽癌CEN1细胞系购自中科院上海细胞库。pSG5-BARF1以及 pSG5空载体稳定转染的CNE1细胞克隆CEN1-BARF1和CEN1-SG各3个，由本室构建与保存，经RT-PCR鉴定，BARF1表达正常。DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物技术有限公司)，FITC标记的羊抗兔IgG、抗荧光淬灭封片剂(武汉博士德生物有限公司)，RIPA裂解液、ECL 试剂、DAPI染液、兔抗 NF-κB p65 、bcl-2和β-肌动蛋白抗体、HRP标记山羊抗兔IgG、NF-κB的特异性抑制剂Bay11-7082(碧云天生物技术研究所)，湿式电泳转移系统、Quantity One图像分析软件(Bio-Rad公司)，PVDF膜(Millipore公司)，化学发光成像仪(Sagecreation公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 CNE1-SG和 CEN1-BARF1细胞用含10% 灭活胎牛血清的DMEM，培养于37℃、5%CO2培养箱中。待细胞长满后，用含0.1%胰蛋白酶和2 mmol/L EDTA的PBS进行消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 荧光抗体染色法检测NF-κB p65核转位将对数生长期的细胞接种于盖玻片，置于6孔细胞培养板内，培养至密度为70%左右。抑制试验则换加含25 μmol/L的 Bay11-7082或DMSO继续培养12 h。以PBS洗2遍，用4%低聚甲醛室温固定1 h后，PBS洗 3遍，每次 10 min。用 0.25%TritonX-100处理10 min以增加细胞膜通透性，加5%BSA室温孵育1 h以封闭非特异性结合位点。加兔抗ΝF-κB p65(1∶200稀释)抗体4℃孵育过夜，次日PBS洗3遍，每次10 min，加FITC标记的羊抗兔IgG(1∶200稀释)，室温孵育40 min，PBS洗3遍，每次10 min，DAPI复染10 min，PBS 洗3 遍，每次10 min，以封片剂封片后于荧光显微镜下观察记录结果。

1.2.3 蛋白质印迹法检测bcl-2蛋白的表达 细胞培养至密度为70%左右，抑制试验则换加含25 μmol/L的Bay11-7082或DMSO继续培养12 h。以PBS洗2遍，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，按说明书进行操作。按每孔30 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，凝胶浓度为12%，采用湿式电泳转移系统转移至0.45 μm孔径的PVDF膜，以含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭1 h，加兔抗bcl-2抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，次日以TBS-T洗3遍，每次10 min后，加HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，TBS-T洗3遍，每次10 min，加ECL试剂，在化学发光成像仪下记录影像。PVDF膜洗去Bcl-2抗体及二抗后，重新与β-肌动蛋白抗体(1∶1 000稀释)及二抗反应。以Quantity One软件分析蛋白条带密度，经β-肌动蛋白校正上样量后进行统计分析。

1.2.4 统计分析 采用SPSS 11.5软件包进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，组间均数的比较采用 t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CNE1-BARF1 中 NF-κB p65 的核转位现象

荧光抗体染色结果显示，NF-κB p65呈绿色荧光，而细胞核呈蓝色。CNE1-SG中p65主要分布于胞质区域，而胞核区较少;CEN1-BARF1中p65主要分布于细胞核区域，而胞质区较少。经Bay11-7082处理后，细胞核区p65减少，而胞质区增加。见图1。

图1 荧光抗体染色法分析CNE1-BARF1细胞中NF-κB p65 的核转位Fig 1 The nuclear translocation of NF-κB was analyzed by fluorescence antibody staining in CEN1-BARF1

2.2 CNE1-BARF1中Bcl-2蛋白的表达

蛋白质印迹结果显示，CNE1-BARF1中Bcl-2蛋白的表达量显著高于 CNE1-SG(t=3.89，P＜0.05)，经Bay11-7082 处理后则显著下降(t=3.13，P ＜0.05)。见图2。

图2 蛋白质印迹法分析CNE1-BARF1细胞中Bcl-2蛋白的表达Fig 2 Bcl-2 protein expression was analyzed by Western blot in CEN-BARF1

3 讨论

BARF1基因存在于EB病毒基因组的BamH IA片段内，编码相对分子质量为(31～33)×103的分泌型蛋白［11］。多种细胞上的研究表明，BARF1具有很强的促有丝分裂原活性，能抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和诱导恶性转化，具有明显的致癌活性［4，5，12-13］，但其机制尚不清楚。

细胞凋亡是多细胞生物体内的一种重要的自稳机制，在精确调控特定细胞的数量及清除具有潜在危险性的细胞等方面发挥重要作用。细胞凋亡的异常与多种人类疾病密切相关，在肿瘤的发生发展中起重要作用。多种外界因素可以影响细胞凋亡的过程，它们通过一定的信号转导途径将胞外刺激信号转换成细胞应答反应，从而实现对细胞凋亡的调控，ΝF-κB信号通路即是其中最为常见的一条。

NF-κB 家族主要包括 NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(p52/p100)，RelA(p65)，RelB，c-Rel等 5 个成员，其亚基间可以通过相互作用形成同源或异源二聚体，p50-p65是其中最为常见的形式。细胞在静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合组成异源多聚体，以无活性的状态存在于细胞质中。当细胞受到NF-κB激活剂刺激时，IκB被磷酸化引起构象改变从而与NF-κB解离，释放出NF-κB，游离的NF-κB从细胞质易位至细胞核内，发挥转录因子活性，从而调节其下游靶基因的表达，引起细胞状态的改变。NF-κB是细胞凋亡调节过程中起关键作用的转录因子，因而与许多肿瘤的发生密切相关。研究表明，许多肿瘤组织中存在 NF-κB的异常活化［9-10］。受NF-κB通路调控的下游靶基因有很多，其中包括一些具有凋亡调节作用的基因，bcl-2是其中最为重要的成员之一［14-15］。许多肿瘤组织中存在bcl-2的过表达，其中不少缘于NF-κB通路的异常激活［15］。

多种致癌因子可以引起NF-κB通路的活化。已有研究表明，BARF1可以通过上调bcl-2基因表达抑制上皮细胞的凋亡［6，16］，但其机制尚不清楚。本研究结果显示，CNE1细胞中表达BARF1后引起了明显的NF-κB核转位和bcl-2基因表达增加，且采用NF-κB的特异性抑制剂Bay11-7082处理后，bcl-2表达明显下降，表明BARF1基因激活了CNE1细胞的NF-κB信号通路，引起了其下游靶基因bcl-2的表达增加，进而抑制了其凋亡进程。

细胞凋亡相关的信号通路调节是一个非常复杂的过程，BARF1通过哪些上游途径活化了NF-κB，以及是否还通过其他途径介导了BARF1对bcl-2表达的上调等问题尚待进一步研究。

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