类风湿关节炎患者外周血髓源性抑制细胞的检测及与Th1/Th2 细胞的相关性分析

许为民，龚爱华，王慧，花盛浩，王旭辉，陈艳，尤海燕，焦志军

(1.江苏大学附属医院检验科，江苏 镇江212001;2.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏 镇江212013)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节和关节周围组织非感染性炎症为主的、系统性自身免疫性疾病。RA 的发病机制仍不清楚，目前认为该病的发生发展与CD4+T 细胞(Th 细胞)亚群失衡及功能异常密切相关［1-2]。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群分化成熟受阻而形成的异质细胞，可通过分泌诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、Ⅰ型精氨酸酶(ARG-1)等抑制T 细胞的增殖和分化［3-4]。此类细胞在RA 外周血中的分布情况尚未见报道。本文拟通过流式细胞术检测RA 患者外周血中MDSCs 的比例并分析其与Th1/Th2 细胞的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2012年4月至7月于江苏大学附属医院门诊及住院的RA 患者36例，其中，男4例，女32例，年龄30 ～80(51.7 ±12.0)岁。所有病例符合1987年美国风湿病学会诊断标准。根据肿胀关节数、压痛关节数、C 反应蛋白、红细胞沉降率等临床检测指标，计算DAS28 评分，分为2 组:活动组(n =20)和稳定组(n =16)。另选江苏大学附属医院健康查体人员10例作为对照组，男2例，女8例，年龄32 ～75(52.1 ±15.2)岁，无类风湿关节炎及其他自身免疫性疾病、感染、肿瘤等。以上标本获取时均取得受试者的知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

荧光标记的抗体:CD4-PE、IFN-γ-FITC、IL-4-FITC、CD14-PEcy5、HLA-DR-FITC、CD11b-APC、CD33-PE(eBioscience);RPMI-1640、Hanks 液、PBS缓冲液、胎牛血清(Gibco);Ficoll 分离液(Lymphoprep);固定破膜剂(Beckman);流式细胞仪(BD FACS Calibur)。

1.3 标本采集

分别抽取RA 患者和健康者外周血3 mL，置于EDTA 抗凝管中。

1.4 MDSCs 膜表面标志染色

取100 μL 抗凝全血于流式管中，加入鼠抗人荧光标志CD14-PEcy5、HLA-DR-FITC、CD11b-APC、CD33-PE 各5 μL，室温避光孵育15 min。加入1 mL溶血剂，混匀，室温避光，反应10 min。PBS 洗涤，2000 r/min，离心5 min。弃上清，加入200 μL PBS，混匀，用流式细胞仪进行检测。

1.5 外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 分离

取抗凝血2 mL，1500 r/min，离心5 min，吸出血浆后，加入等体积PBS 稀释、混匀，按照1 ∶1 比例，移至Ficoll 分离液中，2000 r/min，离心10 min，用吸管将白膜层移入无菌玻璃管，用PBS 洗涤，1500 r/min，离心5 min，弃去上清液。用RPMI-1640 培养液(含10%胎牛血清)调整细胞悬液密度为1 ×106/mL。

1.6 膜表面标志及胞内细胞因子染色

在PBMC 悬液中加入2 μL 佛波醇酯(50 mg/L)和1 μL 离子霉素(100 mg/L)，于37 ℃和5%CO2孵育箱中培养5 h。取出刺激培养的PBMC，用PBS 离心洗涤后加入5 μL CD4-PE，涡旋混匀，室温避光孵育15 min。经洗涤、固定和破膜后将样品分成2 管，分别加入5 μL IFN-γ-FITC 和5 μL IL-4-FITC，混匀，室温避光孵育15 min。PBS 洗涤，离心，弃去上清，加入200 μL PBS，混匀，用流式细胞仪进行检测。

1.7 FCM 检测分析

以CD4+INF-γ+的表达比例表示Th1 细胞百分比，以CD4+IL-4+的表达比例表示Th2 细胞百分比，以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+的表达比例表示MDSCs 百分比。结果分析采用Cellquest软件。

1.8 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism 5.0 软件进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。相关性分析采用Spearman检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA 患者外周血MDSCs 的比例

以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+作为外周血MDSCs 的表面标志，采用流式细胞术四色标志检测36例RA 患者外周MDSCs 比例，结果显示，活动组RA 患者外周血中MDSCs 比例(61.14 ±2.68)%明显高于稳定组(48.29 ±3.96)%和对照组(46.91 ±5.01)%(P 均＜0.05);稳定组虽略高于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

2.2 RA 患者外周血MDSCs 与Th1、Th2 细胞的相关性

在检测MDSCs 的同时，我们检测了外周血中Th1、Th2 细胞的比例，经Spearman 相关分析，结果显示，MDSCs 比例与Th1 细胞比例呈负相关(r =-0.424，P=0.0219)，而与Th2 细胞比例无明显相关性(r=-0.213，P＞0.05)，见图2。

图1 类风湿关节炎患者外周血中髓源性抑制细胞的检测结果Fig 1 Detection of myeloid-derived suppressor cells in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis

图2 类风湿关节炎患者外周血MDSCs 与Th1、Th2细胞的相关性分析Fig 2 The correlations between myeloid-derived suppressor cells and Th1/Th2 cell in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis

3 讨论

MDSCs 是一群具有强免疫抑制功能的异质细胞，通过分泌iNOS、ARG-1、活性氧等产物抑制T 细胞增殖活化，促进T 细胞凋亡，减弱机体的免疫监视功能，从而成为机体抗肿瘤免疫的最主要障碍。MDSCs在自身免疫性疾病中也发挥作用，如Zhu 等［5]、Slaney 等［6]通过对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)动物模型的研究发现，MDSCs 能够发挥免疫抑制作用，缓解EAE 的症状。这一发现使MDSCs 成为近年来研究自身免疫性疾病的新热点。

本研究结果显示，活动组MDSCs 的比例明显高于稳定组和对照组，而稳定组虽然在总体上略高于对照组，但是差异无统计学意义。结果表明，RA 患者外周血中MDSCs 的比例增高，尤其在活动期更为明显。在急慢性炎症患者和动物模型中(如肿瘤［7-8]、急性移植排斥反应［9]以及自身免疫性疾病［5-6，10])，MDSCs 均有显著增高，这与本文的研究结果相一致，说明MDSCs 在炎症状态下显著增多，检测其比例可作为炎性活动的评估指标。

根据上述结果，我们推测RA 外周血MDSCs 增多的可能原因如下。在炎症状态下，大量活化的T细胞亚群、异常增多的炎性因子和趋化因子，通过各种途径，传递信号至骨髓，使得骨髓造血干细胞和祖细胞大量增殖，并且将尚未分化成熟的MDSCs 提前释放入血，当病情稳定以后，由于炎性细胞因子的水平降低，可能刺激招募MDSCs 的信号减弱，所以MDSCs 的比例也逐渐降低。

在本研究中，我们发现RA 患者的病情越严重，MDSCs 的比例越高，增多的MDSCs 似乎未能有效抑制其病情。我们推测可能随着病情的加重，炎症局部的炎性因子水平过高，MDSCs 的抑制能力无法与其抗衡;或者致炎细胞及其分泌的细胞因子阻碍MDSCs 进入炎性局部发挥抑制作用;或者MDSCs 只是受到炎性信号的反馈刺激，仅仅表现为数量上的增多，并无抑制功能;或者MDSCs 本身就是一把双刃剑，在不同的疾病中，扮演不同的角色，促炎或是抑炎。King 等［11]和Milder 等［12]研究表明，内源性的MDSCs 并不能抑制自身免疫性疾病的发展，甚至会加重病情。所以，在后续实验中，我们将进一步研究MDSCs 在RA 中的具体功能。

CD4+T 细胞的大量浸润及其亚群的平衡失调是RA 发病机制的一个重要环节［1-2]。经相关性分析发现，MDSCs 比例与Th1 细胞比例呈负相关，而与Th2细胞比例无明显相关性，表明在RA 患者体内，MDSCs 和Th1 细胞功能可能是互相拮抗的，MDSCs 对体内Th1/Th2 平衡的调节主要在于对Th1 细胞功能的抑制。体外研究［13-14]表明，MDSCs 可抑制Th1 细胞的分化与功能的发挥。此外，Chou 等［15]指出，MDSCs能促进调节性T 细胞(regulatory T celll，Treg)的增殖与分化，降低移植胰岛的排斥反应，促进移植物存活。在RA 中，MDSCs 抑制功能的发挥也可能与Treg 细胞有关，值得进一步研究。

总之，本研究表明，RA 患者外周血中MDSCs 比例增高，且与Th1 细胞呈负相关，有关MDSCs 细胞的功能及其与T 细胞亚群的作用机制有待进一步探讨。

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