TRAIL诱导恶性胶质瘤LN215细胞凋亡抵抗的机制

张艳春 于洪泉 王 猛 赵东海 金 宏 齐 玲 刘兴吉

(吉化集团公司总医院麻醉科，吉林 吉林 132013)

恶性胶质瘤目前尚缺乏理想的治疗方法〔1〕。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)作为一种新型的抗肿瘤药物，在美国已进入临床Ⅱ期实验阶段〔2〕。但大部分恶性胶质瘤细胞株对TRAIL诱导凋亡发生抵抗〔3〕，其机制仍然不清。本文对恶性胶质瘤细胞LN215细胞和单克隆细胞进行研究，为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 重组人TRAIL(rhTRAIL)(Peprotech公司);DMEM/F12培养基、小牛血清(Gibco公司);对硝基苯(上海生物工程技术公司);兔抗人第二个线粒体激活因子(SMAC)多克隆抗体(Biomol公司);兔抗人BH3结构域凋亡诱导蛋白(BID)多克隆抗体(Invitrogen公司);兔抗人肌动蛋白(actin)多克隆抗体(Sigma公司);过氧化物酶标记IgG第二抗体(Jackson Immunoresearch公司)。

1.2 细胞培养及分离单克隆细胞 将LN215细胞接种于含10%小牛血清的DMEM/F12培养基中培养，待细胞汇合至80%～90%，用0.25%胰酶消化，台盼蓝计数后稀释。按1～2个/孔细胞密度接种于96孔板中进行培养。培养条件为5%CO2，37℃孵箱。每天观察生长情况，标记出含单个细胞的孔。待其汇合，转入24孔板中进行培养。每周换液2次，90%汇合后转入65 mm培养皿中进行培养。

1.3 酸性磷酸酶法检测细胞凋亡的百分率 待细胞融合至85%，0.25%胰酶消化，台盼蓝计数活细胞后，以1×104个/孔细胞密度接种于96孔板中，培养24 h，将细胞分为11组，加入TRAIL(0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100，300 ng/ml)，对照组使用基础培养基。24 h后小心弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗去培养基，每孔加入酸性磷酸酶底物检测液(对硝基苯新鲜配制)100μl，继续培养90 min，加入终止液，室温下孵育5 min。酶标仪405 nm处测定各孔光吸收值。按照公式计算细胞凋亡率=(1-药物组光吸收值/对照组光吸收值)×100%。

1.4 Western印迹法检测蛋白的表达 收集细胞，3 000 r/min离心后弃上清。PBS洗涤细胞离心后弃上清，每个管中加入50μl细胞裂解液，12 000 r/min 4℃ 离心 15 min，弃去沉淀，Braford测定法检测样品蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离样品，4℃转膜封闭，加入一抗4℃过夜。加入二抗，室温、避光孵育1 h，胶片曝光拍照。

1.5 统计学分析 采用SPSS11.0软件进行分析，计量资料以±s表示，行t检验。

2 结果

2.1 LN215细胞及单克隆细胞的培养 恶性胶质瘤LN215细胞经复苏后培养，细胞呈现长梭形，有的可见明显的突起。观察96孔板内含单细胞孔细胞的生长状态发现:虽然细胞来自于同一株细胞，但各单克隆细胞生长速度不同、形态也不全相同。待细胞生长至90%时，挑选出生长速度与形态均不相同的32株细胞，用胰酶消化转入24孔板生长，细胞生长状态良好。比较后发现有5株单克隆细胞生长形态、生长速度不同，编号分别是1、6、17、13和32。这5株细胞用于后续实验。

2.2 LN215细胞和单克隆细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性LN215和5株单克隆细胞经不同浓度TRAIL作用后，细胞凋亡率在 -10.2% ～55.7%之间波动，LN215、1、6、17、13 和 32 细胞的最大凋亡率分别为12.1%、3.48%、17.4%、4.85%、55.7%和28.1%，其中6、13和32经TRAIL作用后发生凋亡较LN215更明显，而1和7则相反，以13对TRAIL诱导凋亡最为敏感。见图1。

2.3 LN215细胞和单克隆细胞TRAIL相关蛋白的表达TRAIL相关蛋白均有表达。LN215细胞和单克隆细胞表达DR4与细胞凋亡百分率不相关;BID、SMAC表达与细胞凋亡百分率明显相关，6、13、32较1和17表达量明显增加，尤其是13最为明显。见图2。

图1 TRAIL诱导LN215及单克隆细胞发生凋亡情况

图2 恶性胶质瘤LN214细胞及单克隆细胞TRAIL相关蛋白的表达

3 讨论

胶质瘤是起源于中枢神经系统的最常见肿瘤，由于其发病隐匿，一经发现病理诊断就是Ⅲ～Ⅳ期胶质瘤，给临床治疗带来了很大困难。并且由于脑胶质瘤在脑内呈弥散分布〔4〕，手术难以清除。这可能是由于激活细胞生长途径和/或抑制细胞凋亡途径而对治疗产生抵抗〔5〕。TRAIL可以诱导胶质瘤细胞凋亡〔6，7〕，TRAIL诱导凋亡的非线粒体途径需要线粒体途径的补充，由线粒体途径通过(caspase 8)间接激活BID，再依次与Bax和Bak作用，改变了线粒体膜的生物学特性，促使细胞色素C和SMAC等线粒体蛋白释放。在胞质内，SMAC与相关蛋白作用解除抑制因子的抑制作用，使TRAIL诱导的非线粒体途径得以进行〔8，9〕，细胞发生凋亡。

根据肿瘤发生可能来源于多个细胞的突变，本实验利用细胞梯度稀释方法由LN215分离出5株单克隆细胞。LN215细胞和单克隆细胞BID、SMAC表达与细胞凋亡百分率明显相关。因此，笔者认为LN215和单克隆细胞经TRAIL诱导凋亡百分率与BID和SMAC表达量密切相关，说明TRAIL诱导LN215和单克隆细胞可能是通过BID和SMAC引起，表达量的减少可能会引起TRAIL诱导凋亡抵抗，但更进一步的机制仍待研究。

1 Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med，2005;352(10):987-96.

2 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Revi Rec Clin Trials，2009;(4):34-41.

3 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

4 Holland EC.Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-44.

5 Lefranc F，Brotchi J，Kiss R.Possible future issues in the treatment of glioblastomas:special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells to apoptosis〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(10):2411-22.

6 南栗岩，齐 玲，肖振晶，等.原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;18(1):3591-2.

7 齐 玲，于洪泉，丁丽娟，等.Caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗TRAIL诱导凋亡中的作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2011;37(4):612-6.

8 Li H，Zhu H，Xu CJ，et al.Cleavage of BID by caspase8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis〔J〕.Cell，1998;94(8):491-501.

9 Du C，Fang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition〔J〕.Cell，2000;102(1):33-42.