LC－MS／MS法研究厚朴酚与和厚朴酚在大鼠体内的药动学行为

马莎莎，邵玉凤，吴祥猛，王文艳，，刘万卉

（1.烟台大学药学院，山东 烟台 264005；2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264005）

半夏厚朴汤出自张仲景的《金匮要略》，是由半夏、厚朴、生姜、紫苏、茯苓5味药材组成的经典方剂，是仲景方中治疗情志病的代表方剂。近年来其抗抑郁作用得到了学者们的关注［1－5］，药理研究显示厚朴酚与和厚朴酚作用广泛［6－7］，被初步确定为半夏厚朴汤的主要抗抑郁成分［8－9］，其结构式示于图1，二者均为苯丙素的二聚体。目前，关于厚朴酚与和厚朴酚的测定方法有：荧光分光光度法［10］，该方法操作简单、快速，但是准确度较低；液相色谱法，常与紫外检测器（HPLC－UV）联用，是检测厚朴酚与和厚朴酚最常用的方法，该方法适用范围较广，能够在紫外全扫描图谱中分辨色谱峰的纯度，但是受检测波长的限制，基线不平稳，对定量有干扰［11］；另外还有与质谱检测器［12］、电化学检测器［13］联用等方法。

针对半夏厚朴汤的药物配伍，前人已做了大量研究。徐群等［8］研究了方中君臣佐使分别对于厚朴酚与和厚朴酚溶出的作用；易立涛等［14］研究发现生姜与厚朴配伍后，对于神经递质水平的调节产生了协同作用；且生姜中6－姜醇能够缩短厚朴酚与和厚朴酚在胃内的滞留时间，减少后者从胃肠道中的直接排泄［15］；许腊英等［16］研究发现厚朴经姜炙后其厚朴酚、和厚朴酚的含量都明显增加：和厚朴酚增加约40%，厚朴酚增加约140%。本工作从体内药动学角度出发，采用LC－MS／MS法研究复方中厚朴酚与和厚朴酚的体内行为，并通过与单味厚朴水煎液中两个目标化合物在大鼠体内药动学行为的对比，进一步研究复方中其他药物对于厚朴酚与和厚朴酚药动学行为的影响。

1 实验部分

1.1 主要仪器

TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪：美国Thermo公司产品，配有电喷雾离子化源（ESI）及 Xcalibur1.4控制软件；Agilent 1100液相色谱系统：美国Agilent公司产品，包括四元输液泵、自动进样器、在线脱气机。

图1 厚朴酚与和厚朴酚的结构式Fig.1 Chemical structures of magnolol and honokiol

1.2 主要材料与试剂

半夏、厚朴、茯苓、生姜及紫苏：购自山东医药公司，由烟台大学药学院生药教研室鉴定，结果如下：半夏为天南星科植物半夏pinelliaternate（Thunb.）Breit.的干燥块茎；厚朴为木兰科植 物 厚 朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils的干燥根皮；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf的干燥菌核；生姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鲜根茎；紫苏为唇形科植物紫苏Perillafrytescens（L.）Britt.的干燥叶。厚朴酚与和厚朴酚对照品（纯度＞98%，批号 MUST－11050602）：成都曼思特生物科技有限公司产品；内标萘普生（纯度＞98%）：购自中检所；乙腈、甲醇（色谱纯）：德国Merck公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters XTerra C18柱（100mm×2.1mm×3.5μm）；流动相：V（乙腈）∶V（0.1mmol／L乙酸铵）＝75∶25的溶液；流速0.2mL／min；柱温30 ℃；进样量5μL。

1.3.2 质谱条件 质谱检测采用电喷雾离子化电离源（ESI），源电压3 000V；离子传输毛细管温度350℃；鞘气和辅助气均为氮气，压力分别为2.06×105、3.45×104Pa，厚朴酚、和厚朴酚和萘普生的碰撞能量分别为30、28、20eV；负离子方式检测；扫描方式为选择反应监测（SRM），厚朴酚、和厚朴酚和内标定量分析的离子对分别为m／z265→247，m／z265→224 及m／z229→170。

1.4 溶液配制及样品处理

1.4.1 供试品溶液的配制 称取2倍处方量的药材，加入8倍体积的水，浸泡40min，煎煮1h，过滤，残渣加入6倍量的水再煎煮1h，合并两次滤液；50℃减压浓缩，流浸膏用淀粉吸收后制成颗粒，晾干，研磨成细粉。使用时加热水制成40 mL混悬液。称取2倍处方量的厚朴药材，同法进行处理。

1.4.2 标准溶液的配制 精密称取厚朴酚、和厚朴酚适量，溶于一定量甲醇中配成浓度为1g／L的储备液，置于4℃冰箱中备用。取适当体积的厚朴酚与和厚朴酚的储备液，用甲醇依次稀释 成 浓 度 为：10、20、50、200、500、2 000、5 000、10 000μg／L的工作液，待用。精密称取内标（萘普生）适量，溶于甲醇中配成储备液，置于4℃冰箱中备用。使用时稀释成浓度为500 μg／L的内标工作液，待用。

1.4.3 动物实验 雄性SD大鼠（体重230～260g，山东绿叶制药有限公司动物房提供）12只，随机分为两组，实验前12h禁食。灌胃给予半夏厚朴汤复方及单独厚朴药材水煎液（半夏厚朴汤复方水煎液中和厚朴酚与厚朴酚的浓度分别为1.02、2.55g／L；厚朴水煎液中和厚朴酚与厚朴酚的浓度分别为1.15、2.87g／L），给药剂量厚朴酚约为20mg／kg，和厚朴酚约为8mg／kg。分别于给药前及给药后5min、15min、30 min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h眼内眦取血，每一时间点采血量约为0.3mL，实验过程中大鼠自由饮水。

1.4.4 血浆样品的处理 精密取100μL血浆，加入10μL内标溶液（500μg／L萘普生），50μL 0.05mol／L HCl，涡旋混匀，加入3mL提取液（V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（异丙醇）＝2∶1∶0.1），涡旋3min，离心10min（3 600 r／min），取上清液，35℃空气吹干，100μL流动相复溶残渣，涡旋混合，离心10min（13 000 r／min），取上清液，按照上述色谱及质谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 样品前处理过程 目前生物样品中厚朴酚与和厚朴酚的提取方法有：蛋白沉淀法、液－液萃取法、固相萃取（SPE）法和液相微萃取－非水后萃取法（LPME－NBE）［17］。本实验样品处理采用了经典的液－液萃取法，分别考察了V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（异丙醇）＝2∶1∶0.1溶液及乙酸乙酯的提取效率，前者处理后能较大程度地提高目标化合物的回收率（均在80%以上），故实验中加入3mLV（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（异丙醇）＝2∶1∶0.1溶液，涡旋3 min作为提取方法。另外考虑到目标化合物为弱酸性［18］，为提高其回收率，减少损失，分别考察了处理过程中加入不同浓度的 HCl（0.1、0.05、0.01mol／L）对回收率的影响，结果发现当加入50μL 0.05mol／L HCl时，厚朴酚与和厚朴酚的回收率较另外两者要高。

2.1.2 内标化合物的筛选 分别考察了白藜芦醇及萘普生作为内标的情况。两者的液相行为很相似（在上述液相条件下出峰时间都在1.3 min附近）；从回收率来看，V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（异丙醇）＝2∶1∶0.1条件下白藜芦醇回收率较萘普生要低，最终选择萘普生为内标。

2.1.3 质谱条件 厚朴酚与和厚朴酚互为同分异构体，正离子模式下信号很弱，负离子模式下分子离子峰相同，不能分别进行定量，但二者的二级质谱碎片不同，示于图2。厚朴酚结构中两个羟基距离较近，能够脱去一分子水，形成稳定的环结构，相应碎片m／z247，为厚朴酚的特征二级碎片离子；和厚朴酚二级断裂中则丢掉烯丙基碎片，得到m／z224的特征碎片［19］。在相应的质谱条件下，两者定量离子对互不干扰，信号强且稳定。故通过监测m／z265→247及m／z265→224两离子对，可同时测定厚朴酚与和厚朴酚这对同分异构体。

2.2 方法学确证

2.2.1 专属性 分别取空白血浆、空白血浆加入标准溶液样本及实际生物样本，按上述血浆样本处理方法及检测条件进行定量分析，其色谱图示于图3。结果表明，血浆中内源性物质不干扰厚朴酚、和厚朴酚及内标萘普生的测定，方法专属性良好。

2.2.2 线性关系考察 分别取10μL储备液，加入10μL内标（相当于血浆药物浓度为50 μg／L），100μL空白鼠血，其余操作按1.4.4进行，取上清液进行LC－MS／MS分析。以血浆中药物浓度与内标浓度之比为横坐标，以两者峰面积之比为纵坐标，用加权（W＝1／χ2）最小二乘法进行回归运算，求得回归方程，即标准曲线。厚朴酚的回归方程为y＝0.018 56x＋0.048 00，r＝0.999 6；和 厚 朴 酚 的 回 归 方 程 为y＝0.036 26x－0.000 641 9，r＝0.997 9。二者的线性范围为1～ 1 000μg／L，定量下限为1 μg／L。

2.2.3 准确度与精密度 按照1.4.2项制备低、中、高3个浓度（相当于血浆药物浓度为2、40、800μg／L）的质控样品（QC），每浓度5样本，连续测定3天，根据当日的工作曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算该方法的准确度与精密度，结果列于表1。结果显示，日间、日内变异均小于15%，厚朴酚与和厚朴酚的相对偏差分别为3.4%～6.6%、0.5%～4%，精密度和准确度均较高，重现性较好。

2.2.4 提取回收率 取100μL血浆，按照1.4.2项制备低、中、高3个浓度的质控样品（相当于血浆药物浓度2、40、800μg／L），分别按照1.4.4处理后，取上清液进样，进行LC－MS／MS分析，每一浓度平行3样本分析。另取100μL空白血浆于10mL玻璃管内，加入3mL提取液（V（正己烷）∶V（二氯甲烷）∶V（异丙醇）＝2∶1∶0.1），具塞，涡旋3min混匀，离心10min（3 600r／min），取上清液，35 ℃空气吹干，残渣用流动相复溶，并加入适当体积的工作液，制备成相应浓度的质控样品，涡旋混合，离心10min（13 000r／min），取上清液进行 LC－MS／MS分析，每一浓度平行3样本分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。

厚朴酚低、中、高3个浓度的回收率分别为：（102.3±10.6）%、（94.9±2.0）%、（97.5±6.6）%；和厚朴酚低、中、高3个浓度的回收率分别为：（98.8±6.2）%、（102.4±7.4）%、（93.0±4.2）%；内标的提取回收率为（84.4±5.1）%。

图2 厚朴酚（a）与和厚朴酚（b）的［M－H］－二级全扫描质谱图Fig.2 Full－scan product ion spectra of［M－H］－ for magnolol（a）and honokiol（b）

图3 LC－MS／MS测定大鼠血浆和厚朴酚及厚朴酚的典型色谱图Fig.3 Chromatograms of magnolol and honokiol in rat plasma

2.2.5 定量下限（LLOQ） 分别取10μL厚朴酚与和厚朴酚工作液（浓度均为10μg／L），加入10μL内标（浓度为500μg／L），100μL空白鼠血（相当于含药浓度为1μg／L），其余操作按1.4.4进行，取上清液进行 LC－MS／MS分析。每种化合物5样本平行分析，连续测定3天，根据当日的工作曲线，计算样品的测得浓度，计算该方法的准确度与精密度，结果列于表1。结果显示，LLOQ的日间、日内变异均小于15%。厚朴酚与和厚朴酚的相对偏差分别为0.6%、0.3%，精密度和准确度均较高，重现性较好。

2.3 方法学应用

利用所建立的方法研究大鼠血浆中厚朴酚与和厚朴酚的药动学行为，药时曲线示于图4，主要药动学参数列于表2。从药动学参数来看，给药后目标化合物在复方及单方中的药动学行为有差别：复方的生物利用度较单方要高，消除速率较快，表观分布容积较小。对比两化合物而言，厚朴酚在体内的生物利用度较和厚朴酚高，消除较快。综上可知，复方中其他药物影响了厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的体内药动学行为。

表1 LC－MS／MS法测定血浆中厚朴酚与和厚朴酚的准确度与精密度（n＝15）Table 1 The precision and accuracy of magonol and honokiol in rat plasms by LC－MS／MS

图4 灌胃复方及单方后和厚朴酚（a）与厚朴酚（b）在SD大鼠体内的药时曲线Fig.4 Plasma concentration versus time curves of honokiol（a）and magnolol（b）of Banxia－Houpu decoction and magnolia officinalis

表2 大鼠灌胃给予半夏厚朴汤及单味厚朴水煎液后和厚朴酚与厚朴酚的主要药动学参数Table 2 Pharmacokinetic parameters of honokiol and magnolol in rats after intragastric administration of Banxia－Houpu decoction and magnolia officinalis

3 结论

厚朴是方中臣药，能行气化湿、畅中除满，药理研究表明，厚朴有抗菌抗炎、清除自由基、抗细胞凋亡等作用，其中厚朴酚、和厚朴酚具有抗氧化、神经保护及营养等活性，被初步确定为全方抗抑郁活性主要成分，抗抑郁机制可能与其抗氧化［20］、增强机体免疫能力、调节神经递质的水平等有关［21］。

有关厚朴酚与和厚朴酚在生物体内的药物动力学研究已有报道，但大多都是研究厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的药动学变化［22－24］，而厚朴复方中两者的药代动力学研究较少；而且检测手段以 HPLC－UV为主，分析时间较长。本工作建立的LC－MS／MS分析方法灵敏，大大缩短了分析时间，干扰小，适用于生物样品中厚朴酚与和厚朴酚的研究。从药动学数据来看，两个目标化合物的生物利用度复方与单方存在差别，故推断复方中其他药味配伍后影响了厚朴酚与和厚朴酚的体内过程，仍需进一步研究和探讨。本研究下一步工作计划是从其他多个方面进一步考察配伍的药动学意义。

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