微波辅助萃取－气相色谱－串联质谱法同时测定皮革制品中20种邻苯二甲酸酯含量

王成云，徐 嵘，吴透明，彭圳圳，褚乃清

（深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518045）

我国现已成为世界皮革的加工中心和贸易中心，而欧盟是我国最重要的皮革出口市场，据统计，我国出口的皮革制品中，80%以上出口欧盟［1］。在皮革生产中需要使用大量的加工助剂，其中部分加工助剂对人体健康和环境安全有害。近年来多次在皮革制品中检出邻苯二甲酸酯（PAEs），其具有雌性激素效应，甚至能致癌［2－5］。为保护消费者身体健康，维护环境安全，世界各国纷纷立法限制使用邻苯二甲酸酯，且受限制的邻苯二甲酸酯种类不断增加［6－8］。欧洲化学品管理署现已将邻苯二甲酸二（乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）列为需授权物质，并将邻苯二甲酸二（2－甲氧基乙基）酯（DMOEP）列入第六批高关注物质清单［9－10］。出口欧盟的商品必须满足欧盟委员会关于化学品注册、评估、授权和限制（REACH）法规对高关注物质的有关规定，否则将被召回，甚至被赶出欧盟市场［11］。近年来，已发生多起我国出口欧盟的鞋类产品因检出邻苯二甲酸酯而被召回的事件［12］，对我国皮革制品的出口造成不利的影响。加强对皮革制品中邻苯二甲酸酯的监管，是保障我国皮革制品顺利出口欧盟的重要手段。但目前只有对邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）、DEHP、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、DBP、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）和BBP的检测标准［13］，虽有文献报道了皮革制品中DIBP的测定方法［14］，但并未全部覆盖所有已被列入高关注物质的邻苯二甲酸酯。因此，有必要建立能同时测定包含所有列入高关注物质清单的邻苯二甲酸酯在内的多种邻苯二甲酸酯的测定方法。微波辅助萃取技术具有简便快速、检测通量大、使用化学试剂少等优点［15－18］，而串联质谱法的灵敏度高、受基体干扰少［19－21］。本研究采用微波辅助萃取技术提取皮革制品中的邻苯二甲酸酯，提取物经固相萃取柱净化后进行串联质谱分析，从而建立一种同时测定皮革制品中20种邻苯二甲酸酯的方法，并用于市售皮革制品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MARS 5型微波萃取仪：美国CEM公司产品；Retch SM 2000织物研磨仪：德国 Retch公司产品；Agilent 7890A－7000B三重四极杆气质联用仪：美国Agilent公司产品；Heidolph 4003旋转蒸发仪：德国Heidolph公司产品；氮吹仪：北京康林科技有限责任公司产品；0.45μm滤膜：德国Membrana公司产品；固相萃取柱（中性氧化铝，500mg／3mL）：美国Agilent公司产品。

邻苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二（2－乙氧基乙基）酯（DEOEP）、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）、邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）、邻 苯 二 甲 酸二 （2－丁氧 基 乙 基）酯（DBOEP）、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二戊酯（DAP）、邻苯二甲酸二烯丙酯（DALP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二（2－甲氧基乙基）酯（DMOEP）、邻苯二甲酸二己酯（DHXP）、邻苯二甲酸二丙酯（DPRP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、邻苯二甲酸二庚酯（DHP）、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二（4－甲基－2－戊基）酯（DMPP）、邻苯二甲酸二壬酯（DNP）：均由百灵威公司提供，其纯度均大于99.0%；乙腈、甲醇、环己烷、二氯甲烷、异丙醇、石油醚、三氯甲烷、丙酮、正己烷、叔丁基甲醚、乙醇、乙酸乙酯（分析纯）：广州化学试剂厂产品；甲醇（色谱纯）：TEDIA公司产品。

1.2 标准溶液的配制

准确称取各标准品，用甲醇溶解，配制成适当浓度的标准溶液储备液。分别移取适量的各标准溶液储备液，配制成合适浓度的混合标准溶液储备液，用甲醇逐级稀释至所需浓度。

1.3 样品前处理

样品用织物研磨仪磨成粉末，称取1.0g样品，置于微波萃取管中，加入15mL萃取溶剂进行微波萃取，萃取温度比溶剂的沸点高约20℃。萃取完成后，冷却至室温，收集上清液，用15mL萃取溶剂进行第二次萃取，过滤，合并滤液；滤液

旋转蒸发至近干，在室温下用氮气缓慢吹干。用10mL甲醇溶解残留物，转移至已用5mL甲醇活化的固相萃取柱中进行净化；用10mL甲醇分多次淋洗，收集洗脱液，旋转蒸发至近干后，用氮气缓慢吹干；再用2mL甲醇溶解残渣，定容至25mL；溶液用0.45μm滤膜过滤，进行 GCMS／MS分析。必要时可适当的稀释。

1.4 分析条件

1.4.1 气相色谱条件 Agilent HP－5MS色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升温：初始温度90℃，保持1min，以15℃／min升至210℃，保持2min，以5℃／min升至240℃，保持5min，以5℃／min升至250℃，保持5min，以25℃／min升至300℃，保持4min；传输线温度：280℃；进样口温度：260℃；进样量：1μL；不分流进样；载气：氦气（纯度＞99.999%），流速1.2mL／min；溶剂延迟5.0min。

1.4.2 质谱条件 电离方式：电子轰击离子化（EI）；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电离能量：70eV；氮气流量：1.5mL／min；氦气流量：2.25mL／min；多反应监测（MRM）方式测定，其条件列于表1。

表1 目标物的多反应监测条件Table 1 MRM conditions of targets

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的选择

影响微波萃取效率的主要因素是萃取时间、萃取溶剂种类、萃取压力和萃取温度。较大的萃取压力、较高的萃取温度、较长的萃取时间均有利于提高萃取效率［15］。

通过改变微波萃取时间，观察萃取量的变化。开始时，萃取量随萃取时间的增长而增加，但萃取时间大于15min时，萃取量的变化就很小。在本实验中，为充分保证萃取效果，选择萃取时间为30min。

萃取压力取决于萃取溶剂的体积和萃取温度。通常情况下，萃取溶剂体积约占萃取管体积的三分之一。萃取温度较高时，萃取管内压力也随之升高，萃取溶剂的沸点也相应上升。萃取管材料为聚四氟乙烯，可耐260℃的高温，耐压高达50个大气压。微波萃取温度通常设定为比萃取溶剂的沸点高10～20℃。在本实验中，微波萃取温度设定为比沸点高约20℃。对于每种萃取溶剂，其萃取温度是确定的，因此萃取管内压力也随之确定。

影响萃取效率最关键的因素是萃取溶剂种类。目标分析物在溶剂中的溶解度、溶剂与基体之间的相互作用、溶剂的微波吸收特性等均对萃取效率有影响。本研究选取异丙醇、乙腈、V（三氯甲烷）∶V（甲醇）＝2∶1的溶液、叔丁基甲醚等17种溶剂作为微波萃取溶剂，对一种市售皮革制品中的邻苯二甲酸酯进行微波萃取，考察其萃取效果，结果列于表2。数据表明，对于不同的邻苯二甲酸酯，其最佳萃取溶剂各不相同，而乙腈对于每种邻苯二甲酸酯的萃取效果均较好。综合考虑，选择乙腈为萃取溶剂。

2.2 净化条件的确定

皮革基质相当复杂，萃取液中含有较多杂质，为保护色谱柱，需对其进行净化处理。通常可用固相萃取柱进行净化处理，选择HLB柱、Sep－Pak柱、中性氧化铝柱、LC－C18柱、硅藻土柱等5种常用固相萃取柱净化，结果发现，采用中性氧化铝柱净化时，色谱图中杂质峰最少。用混标溶液分别过柱，测定各固相萃取柱的回收率，结果表明，中性氧化铝柱的回收率远高于其他萃取柱。因此，选择中性氧化铝固相萃取柱进行净化。过柱后，用3mL甲醇多次淋洗固相柱，分别收集每次的洗脱液，经测定，前3次洗脱液中均可检出邻苯二甲酸酯，而第4次洗脱液中则未检出。为尽量收集目标化合物，同时尽可能去除基质干扰，本研究用10mL甲醇分多次淋洗固相萃取柱。

表2 不同溶剂的萃取效果（mg／kg）Table 2 The extraction effects of various solvents

2.3 分析条件的确定

改变气相色谱分离条件，观察各组分的分离情况，选择分离效果最佳时的条件为最终气相色谱分离条件。在此条件下对混标进行单级质谱全扫描分析，确定各组分的保留时间，找出各组分的一级碎片离子。对每个组分选择强度较高的碎片离子作为母离子，在离子轰击扫描模式下进行电离轰击，碰撞能量分别为40、35、30、25、20、15、10、5V，观察产生的二级子离子强度随碰撞能量的变化，二级子离子响应最大的碰撞能量就是最终优化的碰撞能量。选择丰度最高的一对子离子对进行定性定量分析，其中丰度最高的子离子对用于定量分析。在表1列出的条件下，对混标进行分析，得到的MRM总离子流图示于图1。DIDP和DINP均为五指峰，DNP位于DIDP五指峰中间，其余17种邻苯二甲酸酯的分离完全，谱峰峰形尖锐，对称性好。

2.4 线性关系和定量下限

在空白基质中添加不同浓度的混标溶液，按上述条件进行测定，结果发现，对于每个组分，其质量浓度C在一定范围内与响应值A之间有良好的线性关系，线性相关系数r均大于0.996，各组分的线性方程、线性范围及线性相关系数列于表3。在S／N＝10的条件下，确定各组分的定量下限。

2.5 方法的精密度和回收率

对一个市售皮革制品中的邻苯二甲酸酯进行测定，共测定9份平行样，计算方法的精密度，结果列于表4，方法的精密度令人满意。

采用在空白样品中添加混标溶液的方法测定方法的回收率，选用不含目标分析物的皮革制品为空白样品，分别添加低、中、高3个浓度水平的混标溶液，每个浓度水平测试9个平行样，计算各组分的平均回收率，结果表明，方法的平均回收率为87.75%～94.59%。

图1 混标的多反应监测总离子流图Fig.1 MRM total ion chromatography of mixed standards

表3 方法的线性关系和定量下限Table 3 The linear relation and limits of quantification

表4 方法的精密度Table 4 The precision experiment

2.6 实际样品测试

采用本工作建立的方法对47个皮革制品（29个皮鞋样品、18个皮革样品）进行测试，结果在2个样品中检出多种邻苯二甲酸酯，其余45个样品则未检出。2个阳性样品分别为暗红色和墨绿色皮革制品，均检出DINP、DIBP、DEHP和DBP，暗红色皮革制品的含量分别为670.9、17.9、9.6、2.9mg／kg，墨绿色皮革制品的含量分别为632.4、52.3、5.5、4.7mg／kg。暗红色皮革制品萃取液的MRM总离子流图示于图2。

图2 一个实际样品的MRM总离子流图Fig.2 MRM total ion chromatography of a real sample

3 结论

以乙腈为萃取溶剂，采用微波辅助萃取技术提取皮革制品中的邻苯二甲酸酯，提取液经固相萃取柱净化后进行气相色谱－串联质谱分析，从而建立一个同时测定皮革制品中20种邻苯二甲酸酯的气质联用方法。该方法简捷快速、灵敏度高、定量下限低，可以检测对象涵盖了REACH法规中被列入高关注物质清单的所有邻苯二甲酸酯，能满足皮革制品中邻苯二甲酸酯检测的需求。

［1］ 田 美.中国皮革工业现状分析及发展对策［J］.中国皮革，2008，37（1）：42－44.

［2］ 王小逸，林兴桃，客慧明.邻苯二甲酸酯类环境污染物健康研究新进展［J］.环境与健康，2007，24（10）：820－821.

［3］ 魏爱雪，徐晓白.环境中邻苯酸酯类化合物污染研究概况［J］.环境污染治理技术与设备，2005，6（7）：89－93.

［4］ 陈 如，蒋晓琪，王建平.邻苯二甲酸酯及其生态毒性［J］.印染助剂，2010，27（9）：52－56.

［5］ 董夫银，闫 杰.欧盟及美国禁用邻苯二甲酸的法规及其出台始末［J］.检验检疫科学，2006，16（3）：78－80.

［6］ Directive 2005／84／EC of the European Parliament and of the Council of 14December 2005Amending for the 22nd time Council Directve 76／769／EEC on the approximation of the laws，regulations and administrative provisions of the Member States relating to restrictions on the marketing and use of certain dangerous substances and preparations（phthalates in toys and childcare articles）［S］.Official Journal of the European Union，2005，L344：40－43.

［7］ Statement of Policy：Testing of component parts with respect to section 108of the consumer product safety improvement act［S］.CPSC，2008.

［8］ Australian Competition ＆ Consumer Commission.Product Safety Bulletin－Children’s Plastics Products with more than 1percent diethyl hexyl phthalate（DEHP），2010.

［9］ Corrigendum to Commission Regulation（EU）No.143／2011of 17February 2011amending Annex XIV to Regulation （EC）No.1907／2006of the European Parliament and of the Council on the Registration，Evaluation，Authorisation and Restriction of Chemicals （REACH）［S］.Official Journal of the European Union，2011，L49：52－53.

［10］ Commission Regulation（EU）No.125／2012of 14February 2011amending Annex XIV to Regulation（EC）No.1907／2006of the European Parliament and of the Council on the Registration，Evaluation，Authorisation and Restriction of Chemicals（REACH）［S］.Official Journal of the European Union，2012，L41：1－4.

［11］ PUNTENER A G.皮革工业面临的 REACH 条款与挑战［J］.中国皮革，2010，39（1）：23－25.

［12］ 路 华.2011年欧盟非食品快速预警系统（RAPEX）对中国鞋类通报简析［J］.皮革与化工，2012，29（1）：38－38.

［13］ 沈 兵，竺媚筠，赵立国，等.GB／T 22931—2008皮革和毛皮－化学试验－增塑剂的测定［S］.北京：中国标准出版社，2009.

［14］ 李天宝，刘 炜，王春利，等.皮革制品中邻苯二甲酸二异丁酯含量的检测方法研究［J］.西部皮革，2010，32（23）：32－34.

［15］ CANO J M，MARIN M L，SANCHEZ A，et al.Determination of adipate plasticizers in poly（vinyl chloride）by microwave－assisted extraction［J］.J Chromatogr A，2002，963（2）：401－409.

［16］ 李 伟.塑料包装材料邻苯类化合物提取方法的比较［J］.包装工程，2011（32），（7）：47－50.

［17］ 应剑波，谢伟宏，程建波，等.微波萃取－GPC净化－GC／MS法检验血中氨基甲酸酯和沙蚕毒素类农药［J］.质谱学报，2009，30（1）：47－50.

［18］ 王成云，李丽霞，张伟亚，等.微波辅助萃取／气相色谱法测定抗菌纺织品中的三氯生［J］.应用化学，2012，29（1）：118－122.

［19］ 王成云，李丽霞，谢堂堂，等.微波辅助萃取－气相色谱－串联质谱法同时测定纺织品中6种有机磷阻燃剂［J］.色谱，2011，29（8）：731－736.

［20］ 王成云，谢堂堂，张伟亚，等.微波萃取－GC／MS／MS测定抗菌织物的三氯生含量［J］.印染，2011，37（20）：32－35.

［21］ 王成云，张伟亚，谢堂堂，等.气相色谱／串联质谱法测定塑料制品中的禁用芳香胺［J］.塑料科技，2011，39（6）：66－70.