天然同位素信息在多级质谱裂解规律解析中的应用——以磺胺类化合物为例

张海燕，刘 鑫，严 华，李建辉，韩 深，张朝晖，王金花，许 泓，叶晓霞

（1.温州医学院药学院，浙江 温州 325000；2.北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室，北京 100026；3.天津出入境检验检疫局动植物食品中心，天津 300000）

质谱是对未知化合物分子进行定性和解析的重要工具［1－5］。通过质谱获得化合物的分子质量信息，可以为确定化合物的元素组成提供一定的帮助，但是要获得化合物的准确分子式仍有相当大的难度。现代的高分辨质谱仪（Orbitrap、Q－TOF和FTICR－MS）为未知化合物定性提供了更高的质量精度（质量误差小于5×10－6），大大缩小了待选化合物分子式的范围，但对元素组成复杂的化合物，即使质量误差小于5×10－6，仍有许多待选分子式［6］。为进一步确定化合物的分子组成，应用同位素信息对化合物的分子组成进行判断已成为重要的手段［7－9］。应用一级质谱获得同位素分布信息，从而确定化合物分子式的方法已在药物分子［10］及代谢产物的鉴定［6，11－13］、环境与安全［14］、农药的定性分 析［15］、非目标化合物扫描［16－17］以及天然产物研究［18］等领域得到广泛应用。目前，人们主要关注母离子的同位素分布信息，却很少有文献报道化合物子离子的同位素丰度和峰形信息。这是由于大部分实验都是选用目标化合物的最丰同位素母离子（most abundant isotopic peak）进行裂解，得到仅含有单同位素裂解信息的子离子（monoisotopic peak），这种实验方法忽略了对天然同位素信息的利用。Alon等［19］使用超声波三重四极杆气质联用仪（supersonic GC／MS）对二级子离子的天然同位素丰度比进行研究，并用作者设计的Tal－Aviv IAA软件对EI源裂解的化合物碎片同位素信息进行分析，通过对离子碎片进行解析确定了最匹配的候选分子式。目前，还没有相关文献报道在ESI源下利用高分辨质谱的精确质量数信息及同位素丰度信息对化合物子离子的多级质谱裂解规律进行分析。

对于高分辨质谱，通过精确质量过滤可以很好的减少待选分子式，应用同位素信息，通过对质量轴、质谱峰形变异和随机噪声进行校正，可以进一步减少候选分子式的数量。质谱采集的同位素信息不仅包括同位素丰度比，还包括同位素峰的轮廓信息。应用同位素轮廓信息能够更准确的从质谱图得到质荷比推测分子式［20］。Gu等［21］用 MassWorks软件校正谱图，解析同位素轮廓信息，并提出了“谱图准确度”（spectral accuracy）的概念。李雪生等［15］运用“谱图准确度”方法在单位分辨质谱仪GC／MS上实现了目标农药分子式的准确识别。然而，现有“谱图准确度”的文献仅局限于一级质谱的分析，并未在多级质谱中应用。

本研究采用LTQ－Orbitrap XL高分辨质谱仪，通过改变离子阱质谱中的重要参数isolation width，建立在高分辨质谱仪上获得子离子同位素信息的方法，并根据同位素丰度比和同位素峰形进行子离子结构的解析。以磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）子离子的同位素峰信息为例，使用Xcalibur软件模拟子离子的同位素丰度比与实测值进行比较，通过同位素峰形信息确证子离子的元素组成。为进一步确证该法的可行性，本研究运用MassWorks软件对子离子碎片进行质谱轮廓分析。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

LTQ－Orbitrap XL线性离子阱－轨道离子阱高分辨组合式质谱仪：美国ThermoFisher Scientific公司产品，配有电喷雾离子源（ESI源）。

磺胺甲基嘧啶（纯度＞98%）：购于Dr.Ehrenstorfer公司；标准品用50%甲醇水溶液配制成100μg／L溶液；其他试剂均为色谱纯；试验用水为Milli－Q超纯水。

1.2 质谱条件

质量分析器：Orbitrap；离子化方式：ESI＋；喷雾电压：4.5kV；管状透镜电压：115V；鞘气（氮气）流速：25L／min；辅助气（氮气）流速：3.00L／min；毛细管温度：350 ℃；质量扫描范围：m／z50～300；静电场轨道阱的高分辨扫描：分辨率R＝30 000；高能诱导裂解（HCD裂解），归一化能量：55%；isolation width：1u或6u。

1.3 试验方法

蠕动泵直接进样，流速10μL／min。按照1.2条件进行检测，记录总离子流图、质谱图和精确质量数。通过离子阱的二级质谱图和Xcalibur软件模拟质谱图对化合物进行确认，并用MassWorks软件对子离子碎片进一步确认。

2 结果与讨论

2.1 多级质谱同位素峰的理论分布

将化合物的同位素峰定义为A、A＋1、A＋2、A＋3和A＋4（A＋i表示i个附加的中子），A为轻同位素峰，A＋1、A＋2、A＋3和A＋4为重同位素峰［8］，同位素丰度的比值以元素同位素的贡献率计算得出。以含有硫元素的化合物磺胺甲基嘧啶（C11H12N4O2S）为例，其子离子可分为含硫和不含硫两类，示于图1［22］。其子离子［C6H6NSO2］＋的 A峰是轻同位素峰［12C6H614N32S16O2］＋，将丰 度 设 定 为 100%；A＋1 峰 由 ［13C12C5H614N32S16O2］＋（6.48%）、［12C6DH514N32S16O2］＋（0.07% ）、［12C6H615N32S16O2］＋（0.37%）、［12C6H614N33S16O2］＋（0.80%）和［12C6H614N32S17O16O］＋（0.08%）等组成，由于13C 的 同 位 素 丰 度 较2H、15N、17O 和33S高，因此A＋1峰的丰度和峰形主要由［13C12C5H614N32S16O2］＋决定；同理，因34S对 A＋2峰贡献最大，A＋2的丰度和峰形是由［12C61H614N34S16O2］＋（4.52%）决 定，［12C6H614N32S18O16O］＋（0.42%）、［13C12C5H615N32S16O2］＋（0.02%）等10个峰是 A＋2的次要组成部分。上述各峰共同组成了［C6H6NSO2］＋的A、A＋1和A＋2同位素峰。

2.2 Isolation width对质谱采集同位素峰的影响

离子阱的isolation width是获得多级质谱中重同位素信息的重要参数。当isolation width设为1u时，母离子选择范围在［M＋H］＋±0.5u之间，子离子峰仅有m／z108.044 29，其重同位素没有被选中，而无相应的碎片同位素峰，示于图2a－1。当isolation width设为6u时，即母离子选择范围在［M＋H］＋±3.0u之间，除产生m／z108.044 30峰外，还检测到m／z109.047 45的重同位素峰，示于图2a－2。同理，对于图2中列出的其他子离子，当isolation width设为1u时，只产生m／z92.049 33和m／z65.038 40；当isolation width设为6u时，可以检测到相应的重同位素峰m／z93.052 57和m／z66.041 67。这与仪器配套软件Xcalibur模拟的［C6H6NO］＋（图2a－3）、［C6H6N］＋（图2b－3）和［C5H5］＋（图2c－3）相符，具体相对丰度比列于表1。因此，在试验过程中，选择isolation width为6u进行下一步试验。

2.3 多级质谱同位素峰推测化合物的分子组成

以磺胺甲基嘧啶为例，当子离子分子式由C、H、O和N元素组成时，对重同位素丰度比和峰形贡献较大的主要是C，多级质谱的同位素峰应包含A和A＋1峰；当化合物的分子组成含S时，其同位素峰主要由C和S的含量共同决定，多级质谱的同位素峰应包含A、A＋1及A＋2峰。通过以上规律，分析质谱采集到的同位素峰的组成，可以判断化合物的元素信息。

对子离子m／z108.044 39、92.049 48和65.038 58，质谱只检测到相应的A和A＋1峰，而无明显的A＋2峰，可以判断这几个子离子是不含S的子离子。对于含S的子离子，m／z156.011 38在质谱上产生 A（m／z156.011 38，100.00%）、A＋1（m／z157.014 91，5.26%）和A＋2峰（m／z158.007 13，4.19%），其丰度比符合S元素的分布规律，这与Xcalibur软件模拟的［C6H6NSO2］＋（图2d－3）相符，具体相对丰度比列于表2。

图1 磺胺甲基嘧啶的结构式及HCD质谱裂解Fig.1 The structure and HCD fragmentation pathway of sulfamerazine

表1 磺胺甲基嘧啶离子碎片理论同位素和实测同位素（isolation width＝6u）分布信息Table 1 Comparison of accurate mass acquired by Orbitrap（isolation width＝6u）and the isotope pattern predicted by the Xcalibur software

图2 在不同isolation width下磺胺甲基嘧啶子离子同位素丰度信息Fig.2 Tandem mass isotope pattern acquired by Orbitrap in different isolation width

表2 子离子峰m／z 156.011 38和m／z 65.038 58的 MassWorks检索结果Table 2 Search result of fragment ion peaks（m／z 156.011 38and m／z 65.038 58）by MassWorks

2.4 由同位素峰轮廓推测化合物的分子组成

用MassWorks对磺胺甲基嘧啶子离子的精确分子质量及元素组成进行识别。选取精确分子质量156.011 4和65.038 3，以离子电荷数为1，质量误差为5×10－6，C、H、O、N及S为可能含有的元素，利用MassWorks同位素峰形校正检索技术（sCLIPS），通过同位素峰形轮廓匹配原则，推测m／z156.011 38和m／z65.038 31的分子式，分别示于图3和图4。子离子m／z156.011 4经软件检索只得到分子式［C6H6NSO2］＋，该分子式的理论值与仪器获得的m／z156.011 4质量误差为0，A、A＋1和 A＋2同位素峰轮廓显示很好的匹配性，匹配度达到96.1%，故推测该离子是［C6H6NSO2］＋；子离子m／z65.038 3经软件检索只得到分子式［C5H5］＋，该分子式的理论值与仪器获得的m／z65.038 6质量误差为－4.61×10－6，A、A＋1和A＋2同位素峰轮廓显示很好的匹配性，匹配度达到99.2%，故推测该离子是［C5H5］＋。

据文献［23］报道，磺胺甲基嘧啶在EI源上裂解产生的子离子m／z65的分子式为HS·＋O2。本研究运用ESI源产生质荷比为m／z65的子离子，其精确质量数m／z65.038 31与HS·＋O2（计算值m／z64.969 18）质量误差为1.06×10－4，推断该子离子的分子式不是HS·＋O2。根据本研究的结果，证明了m／z65.038 31对应的分子式是［C5H5］＋。

图3 MassWorks准确识别m／z 156.011 4分子式的结果Fig.3 The spectral accuracy and mass error of［C6H6NSO2］＋ （m／z 156.011 4）with mono isotope value showed by MassWorks software

图4 Mass Works准确识别m／z 65.038 3分子式的结果Fig.4 The spectral accuracy and mass error of［C5H5］＋ （m／z 65.038 3）with mono isotope value showed by MassWorks software

2.5 方法验证

用磺胺对甲氧嘧啶对该方法进行验证，碎片离子m／z156.011 38 在质谱上产生 A（m／z156.011 34，100.00%）、A＋1（m／z157.014 51，5.42%）和 A＋2峰（m／z158.006 99，3.01%），其丰度比符合S元素的分布规律，示于图5。对于碎片离子m／z108.044 39，质谱只检测到相应的A（m／z108.044 23，100.00%），和A＋1峰（m／z109.047 53，4.12%），而无明显的 A＋2峰，示于图6。

图5 在isolation width＝6u下磺胺对甲氧嘧啶子离子 m／z 156.011 34的同位素丰度信息Fig.5 Tandem mass isotope pattern acquired of sulfameter（m／z 156.011 34）under isolation width＝6u

图6 在isolation width＝6u下磺胺对甲氧嘧啶子离子 m／z 108.044 23的同位素丰度信息Fig.6 Tandem mass isotope pattern acquired of sulfameter（m／z 108.044 23）under isolation width＝6u

3 结论

本研究通过扩大isolation width进行多级质谱试验，得到磺胺甲基嘧啶的子离子同位素信息，根据子离子同位素丰度比和峰形产生的原理，分析子离子的分子组成，为磺胺类化合物的裂解机理提供了更丰富和准确的依据。在多级质谱试验中关注同位素丰度和峰形信息，可以快速排除绝大多数假阳性待选分子式，使结构解析更加快捷准确。

致谢：感谢北京绿绵科技有限公司李斌工程师为本研究进行数据处理工作。

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