稳定转染重组信号转导及转录激活因子3对喉癌Hep－2细胞侵袭性的影响

孙红村 郭明丽 王俊阁 张建耀

研究［1-2］证实，体内绝大多数肿瘤组织中都有信号转导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的异常活化，如中枢神经系统肿瘤、呼吸道肿瘤、消化道肿瘤、乳腺癌、黑色素瘤、皮肤癌及头颈部肿瘤等。由于细胞外的配体与细胞表面的受体结合，STAT3信号转导通路得以激活，进而调控肿瘤的增殖和侵袭［3］。实验［4］发现，STAT3 在喉癌中的表达与临床分期、分级及淋巴结转移有明显关系。前期实验我们成功筛选出了稳定表达siRNA-STAT3的Hep-2细胞系［5］。本实验在此基础上将观察STAT3被抑制后Hep-2细胞侵袭性的变化及下游细胞外基质黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表达，探讨其可能的侵袭机制，为临床通过基因沉默技术治疗喉癌提供实验支持和理论依据。

1 资料与方法

1.1 材料及仪器 喉鳞癌细胞系Hep-2(美国国家癌症研究所病理实验室提供，白求恩国际和平医院保存)，RPMI 1640培养基 (Gibco公司，美国)，HRP-山羊抗鼠 IgG和 ICAM-1、VEGF鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，细胞培养板(Costar公司，美国)，Matrigel胶(B.D.公司，美国)，Transwell小室(Corning公司，美国)，光学显微镜(Olympus公司，日本)，Leica B6120温箱(Heraeus公司，德国)，荧光倒置显微镜(Leica公司，德国)。STAT3(2144-2162)正义链序列为5'-CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCA AGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG-3'，反 义链5'-GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCT CTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGC-3'。同时设阴性对照 shNC，其序列如下:正义链 5'-CACCGTT CTCCGAACGTTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTT CGGAGAATTTTTTG-3'，反 义 链 5-GATCCAAAAAAT TCTCCGAACGTGTCCGTAATCTCTTGACGTGACACGTT CGGAGAAC-3'。

1.2 研究分组 研究分为3组:①空白对照组;②重组siRNA-STAT3质粒组;③重组siRNA-shNC组(无关质粒)。

1.3 细胞黏附实验 用无血清RPMI1640培养基按3∶1比例稀释Matrigel胶。96孔培养板中加入Matrigel胶稀释液及细胞。先行MTT比色法检测黏附细胞吸光值:37℃孵育20、40、60min后，吸出未黏附细胞，每孔添加新鲜培养基及MTT液(5mg/mL)及DMSO。测定各孔细胞在490 nm波长处的吸光值(A值)。检测总细胞吸光值:各组细胞37℃孵育4 h后，每孔直接添加等量MTT，余同前操作。细胞黏附率(%)=(黏附细胞A值/总细胞A值)×100%。

1.4 细胞迁移实验 接种细胞于96孔板中培养24 h。用移液器枪头(10 μL)沿培养孔底部呈“│”形划痕;用无血清培养液洗涤，更换含1%胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h，再换用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养24 h。观察划痕区细胞迁移情况并照相。

1.5 细胞侵袭实验 稀释Matrigel胶(1∶3)。Transwell上室加入细胞和无血清RPMI1640培养基，下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640培养基，培养24 h。取出上室，擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。甲醇固定，行苏木精染色。取下聚碳酯膜，将有细胞的一面置于载玻片上，高倍镜下(×200)观察视野内的细胞数。

1.6 Western印迹法检测ICAM-1和VEGF蛋白的表达 提取细胞总蛋白。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。转膜时，设置 ICAM-1和VEGF抗体转膜条件为350 mA，1.5 h。分别加入ICAM-1和VEGF抗体及HRP标记的二抗，最后显影及定影。

1.7 统计学处理 所有数据经Excel软件整理，应用SPSS 11.0软件处理数据，计量资料采用均数±标准差表示;3组均数的比较用ANVOA方差分析;组间比较和两因素比较采用t检验;P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测各组细胞的黏附能力 应用MTT测定细胞在Matrigel基质上的黏附性呈现一定的时间-效应关系:接种细胞20min后观察各组细胞的黏附率相差不大(P＞0.05)，40min后 siRNA-STAT3组的黏附率小于 siRNA-shNC组和空白对照组(P＜0.05)，STAT3被抑制后黏附抑制效应在60min后更加明显(P ＜0.05)(表 1)。

表1 各组细胞在Matrigel基质上的黏附率()

表1 各组细胞在Matrigel基质上的黏附率()

细胞接种时间(min)n 黏附率(%)siRNA-STAT3 siRNA-shNC F值 P值空白组20 5 49.62 ±3.84 50.58 ±3.38 51.06 ±3.87 0.124 0.88640 5 75.90 ±2.20 83.06 ±5.51 86.96 ±5.04 8.063 0.02060 5 82.38 ±1.76 93.60 ±1.93 93.94 ±2.35 12.5270.012

2.2 细胞划痕法检测各组细胞的迁移能力 接种培养板48 h后，荧光显微镜下见空白组和siRNA-shNC组的Hep-2细胞向划痕区生长速度明显快于siRNASTAT3组，而空白组和siRNA-shNC组的Hep-2细胞向划痕区生长速度基本一致(图1)。

2.3 Transwell法检测各组细胞的侵袭能力 以细胞穿过Matrigel基质的能力量化其侵袭能力。本实验各组细胞接种Transwell小室24 h后，siRNA-STAT3组穿至滤膜下面的细胞数明显低于空白对照组和siRNA-shNC组(图2)。

图1.接种培养板48 h后各组细胞的迁移变化(10×20)

图2.稳定转染siRNA-STAT3对Hep-2侵袭能力的影响(苏木精染色，10×20)

2.4 Western印迹 结果显示，siRNA-STAT3组VEGF和ICAM-1蛋白的表达量均低于空白组和siRNA-shNC组(图3)。

图3.ICAM-1，VEGF表达量的变化

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的特性之一，也是目前治疗效果较差的原因之一。STAT3信号传导通路参与肿瘤的侵袭及转移。人类黑色素瘤中STAT3的异常表达能显著提高癌细胞脑转移的机会［6］，说明活化的STAT3对肿瘤的侵袭及转移起着重要作用。Dien等［7］证实了p-STAT3在有局部淋巴结转移的乳腺癌中存在高表达，提示STAT3的异常激活可能与乳腺癌的细胞侵袭性有关。有实验［4］表明，STAT3与喉癌的侵袭也呈正相关。

肿瘤细胞与细胞外基质黏附在其侵袭和转移过程中起着极为重要的作用。由于Matrigel胶经重建后能在聚碳酸滤膜表面形成类似天然基底膜的结构，借助Matrigel胶通过 MTT法观察黏附的细胞数能模拟Hep-2细胞的黏附能力。本实验发现，随着接种培养板的时间延长，siRNA-STAT3组Hep-2细胞与细胞外基质黏附率逐渐下降。说明STAT3基因表达被沉默后，Hep-2细胞在人工基质上的黏附力下降，提示STAT3基因能够释放出某种信号，以增加相关黏附蛋白的表达，使喉癌细胞群扩散，并不断与细胞外基质接触和黏附，进而打开侵袭的大门。ICAM-1作为黏附蛋白已被证实在肿瘤中存在着高表达，其作用与肿瘤细胞的黏附和迁移明显相关［8-9］。而且本实验在稳定转染siRNA-STAT3的细胞中检测到ICAM-1的表达下降，说明ICAM-1在喉癌细胞黏附细胞外基质中起着重要作用。另外，ICAM-1高表达的细胞更易出现血行转移，这是因为ICAM-1能使已入血的肿瘤细胞顺利黏附到血管内皮细胞上［10］。

由于喉癌侵袭以局部浸润为主，所以需具备一定的运动能力，才能到达相邻正常组织。为了证实STAT3信号通路与喉癌Hep-2细胞的迁移关系，通过划痕实验发现接种培养板48 h后，siRNA-STAT3组的Hep-2细胞向划痕区生长速度明显落后于空白对照组和shNC组，表明激活的STAT3能增强Hep-2细胞的运动能力。由于喉癌细胞迁移伴随着侵袭的整个过程，整个迁移过程中STAT3信号通路到底发挥多大作用也决定着喉癌的侵袭能力。肿瘤的迁移模式分为阿米巴式迁移和间充质式迁移。当上皮细胞可塑性变化时，这两种模式可相互转变［11］。

喉癌侵袭和转移最关键的一步就是黏附并降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。ECM包括胶原、纤黏蛋白及层黏蛋白等。肿瘤细胞从原发部位脱落后，入侵到ECM，与基底膜和细胞间质中一些分子黏附，通过分泌各种降解酶，协助肿瘤细胞穿过ECM进入血管。Transwell小室和Matrigel胶可以模拟细胞外基质的结构。我们在实验中观察到，STAT3干扰组穿过基质和滤膜喉癌Hep-2细胞数明显低于其他两组，说明STAT3的表达被抑制后，Hep-2细胞侵袭能力下降，提示STAT3信号通路能增强喉癌细胞降解基质的能力来增强其侵袭性，以便其能更好地向周围正常组织扩散和生长。

癌细胞的血管生成作用作为侵袭的终末环节，能体现恶性肿瘤的侵袭力，其中VEGF蛋白的表达对肿瘤侵袭的影响至关重要。由于它能显著促进原发瘤的生长和转移，故其生物学特征影响着肿瘤发生、转移及预后［12］。本实验观察到STAT3表达被抑制后 VEGF的表达明显下降，推测Hep-2细胞侵袭力的下降与VEGF表达下降有关。

喉癌Hep-2细胞的黏附、迁移、降解基质及血管生成作用的能力均伴随着侵袭的整个过程，各个环节又相互作用，相互影响。STAT3信号通路的激活能够影响喉癌的侵袭和转移，从根本上说与相关蛋白的活性增强或表达增加有关。总结本次实验，我们认为VEGF和ICAM-1作为两个特征性蛋白的高表达共同参与了STAT3信号通路对喉癌Hep-2细胞的调控。它们表达的高低直接影响Hep-2细胞的黏附、迁移、降解基质及血管生成的作用。

总之，我们发现STAT3能提高喉癌细胞的黏附、迁移、降解基质及血管生成能力，其机制可能与ICAM-1和VEGF的表达有关。另外本实验也提示我们应用RNA干扰技术沉默STAT3的表达能显著抑制喉癌细胞的侵袭性。但由于STAT3信号通路的调控非常复杂，对STAT3作用于喉癌细胞的侵袭机制的研究仍需不断深入。

［1］Masuda M，Wakasaki T，Suzui M，et al.STAT3 orchestrates tumor development and progression:the Achilles＇heel of head and neck cancers?［J］.Curr Cancer Drug Targets，2010，10(1):117-126.

［2］Johnston PA，Grandis JR.STAT3 SIGNALING:anticancer strategies and challenges［J］.Mol Interv，2011，11(1):18-26.

［3］Ghoshal GS，Baumann H，Wetzler M.Epigenetic regulation of signal transducer and activator of transcription 3 in acute myeloid leukemia［J］.Leuk Res，2008，32(7):1005-1014.

［4］王俊阁，李晓明，路秀英，等.STAT3信号传导通路在喉癌中的表达及意义［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2009，16(3):115-118.

［5］孙红村，王俊阁，皮丽宏，等.稳定表达siRNA-STAT3基因Hep-2细胞系的建立［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2010，17(8):399-402.

［6］Lee I，Fox PS，Ferguson SD，et al.The expression of p-STAT3 in stage IV melanoma:risk of CNS metastasis and survival［J］.Oncotarget，2012，3(3):336-44.

［7］Dien J，Amin HM，Chiu N，et al.Signal transducers and acti-vators of transcription 3 up-regulates tissue inhibitor of metallo-proteinase-1 expression and decreases invasiveness of breast cancer［J］.Am J Pathol，2006，169(2):633-642.

［8］Hayes SH，Seigel GM.Immunoreactivity of ICAM-1 in human tumors，metastases and normal tissues［J］.Int J Clin Exp Pathol，2009，2(6):553-560.

［9］Gogali A，Charalabopoulos K，Zampira I.Soluble adhesion molecules E-cadherin，intercellular adhesion molecule-1，and E-selectin as lung cancer biomarkers［J］.Chest，2010，138(5):1173-1179.

［10］Dymicka PV，Kemona H.Does colorectal cancer clinical advancement affect adhesion molecules(sP-selectin，sE-selectin and ICAM-1)concentration?［J］.Thromb Res，2009，124(1):80-83.

［11］Van ZF，Krupitza G，Mikulits W.Initial steps of metastasis:cell invasion and endothelial transmigration［J］.Mutat Res，2011，728(1/2):23-34.

［12］Ghosh S，Sullivan CA，Zerkowski MP，et al.High levels of vascular endothelial growth factor and its receptors(VEGFR-1，VEGFR-2，neuropilin-1)are associated with worse outcome in breast cancer［J］.Hum Pathol，2008，39(12):1835-1843.