HPLC 法测定柴胡不同部位4种黄酮类成分

袁王俊， 张维瑞， 吴宏欣， 薛愧玲， 李 勉*

（1.河南大学中药研究所，河南开封475004；2.河南大学生命科学学院，河南开封 475004）

HPLC 法测定柴胡不同部位4种黄酮类成分

袁王俊1， 张维瑞1， 吴宏欣2， 薛愧玲1， 李 勉1*

（1.河南大学中药研究所，河南开封475004；2.河南大学生命科学学院，河南开封 475004）

目的 定量测定开封市场上不同部位和不同产地柴胡中4种黄酮 （芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素）。方法以ODS2色谱柱、乙腈-0.12%磷酸水为流动相进行梯度洗脱，体积流量为1 mL/min，检测波长为360 nm。结果

样品间的黄酮成分的量存在明显差异。叶片中芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量远远高于柴胡根中。结论 柴胡茎和叶中4种黄酮总量远远高于传统的入药部位根中的量，有必要对柴胡茎、叶进行进一步的研究和开发。

柴胡；HPLC；根；茎；叶；黄酮

中药柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.和狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，前者习称北柴胡，后者习称南柴胡。柴胡始载于《神农本草经》，列为上品［1］。柴胡能疏散退热，疏肝解郁，升举阳气，用于感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等症［2］。现代药理研究表明，柴胡还具有抗炎、促进免疫功能，抗肝损伤和抗辐射损伤等作用［3］。柴胡在我国分布广泛，除西藏外，各地均有分布。

柴胡为常用大宗药材，其重要的药用价值使需求逐年增加，不仅国内需要量大，且大量出口。由于长期依赖采挖，野生资源及其生境破坏严重，资源已近枯竭，目前商品柴胡主要依赖栽培。柴胡存在严重的种内和种间类型混杂的现象。导致柴胡品种优劣不等的问题［4］。不同地区使用的药用部位也不尽相同。药典规定柴胡的药材为柴胡的根，但市场上的药材往往是根和5～10 cm的茎的混品入药。有人则以地上部分入药。

柴胡中的有效成分为柴胡皂苷、甾醇、挥发油和多糖等，此外，还含有黄酮类成分，黄酮类化合物对人体在抗肿瘤、抗衰老及心血管等疾病的治疗和预防有重要意义［5-6］。如芦丁具有抗氧化、抗基因突变和降低毛细血管异常通透性及脆性的作用，临床上用于治疗过敏性紫癜及各种因毛细血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治疗高血压和老年气管炎等。槲皮素是黄酮类化合物中具有代表性的一种，研究发现槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并发症等多种生物活性及药理作用，对呼吸道疾病，特别是对哮喘病和支气管疾病有较好的作用［7-8］。

本研究采用HPLC法对来自开封市场上的柴胡样品进行了分析，（1）考察不同产地的柴胡药材中4种黄酮类成分的量；（2）考察同批药材根、茎、根和茎混品4种黄酮类成分的量；（3）考察叶、茎、茎叶混合品的4种黄酮类成分的量。

1 药材、仪器与试剂

1.1 药材来源 柴胡药材共7批，其中原药材2批，分别来自巩义五指山和洛阳嵩县，来自陕西的1批药材为茎叶混品，狭叶柴胡的根 （南柴胡）2批 （编号18和19），其余均为饮片，所有药材购自开封各药店和医院药房。经李勉高级实验师鉴定为柴胡Bupleurum chinense的根 （包含5～10 cm的茎）、茎叶和狭叶柴胡B.scorzonerifolium的根。

芦丁 （批号20736-09-8）、槲皮素 （批号117-39-5）、山柰素 （批号491-54-3）、异鼠李素 （批号480-19-3）的对照品均购自上海华蓝化学科技有限公司，纯度均大于98%。

1.2 仪器与药品 Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国 Agilent公司，包括 G1311C四元梯度泵，G1329B自动控温自动进样器、G1316A柱温箱、G1314B可变波长紫外检测器；ChemStation6.01色谱工作站）。乙腈、磷酸均为色谱纯，水为乐百氏纯净水，甲醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品处理 为了分析根所带部分茎对药材质量的影响，将来自洛阳嵩县和河南巩义的药材分为根、茎和根与茎 （1∶1）混合3种。同时将来自陕西的地上部分分为叶、茎和叶与茎 （1∶1）混合3种。将材料40℃烘干，粉碎，过60目筛。取各样品粗粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水温超声处理1 h，滤过，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中定容，用0.45 μL微孔滤膜滤过［9］。

2.2 定量测定

2.2.1 色谱条件 依利特Hypersil ODS2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相为乙腈 （A）-0.12%磷酸水 （B）梯度洗脱，0～15 min（5% ～20%A）15～30 min（20% ～25%A），30～45 min（25% ～45%A），45～55 min（45% ～50%A），55～60 min（50% ～5%A）；洗脱时间为60 min；检测波长360 nm；流量1.0 mL/min；柱温为常温，进样量20 μL。

2.2.2 标准曲线及线性范围 准确称取芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品各约5 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。混匀后分别进样 5、10、15、20、25 μL，按上述色谱条件作HPLC分析。以峰面积对进样量进行回归处理，得芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的线性回归方程和线性范围，见表1。

2.2.3 精密度试验 将柴胡皂苷混和对照品溶液按同样色谱条件进行HPLC分析，连续进样6次，每次进样10 μL，芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素 的 RSD 分 别 为 1.37%、1.375%、1.35%、1.61%。

表1 4种黄酮标准曲线Tab.1 Calibration curves of four flavonoids

2.2.4 重复性试验 准确称取7号样品粗粉约10 g，一式5份，按样品溶液制备方法进行提取，按上述色谱条件进样20 μL，结果样品中芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的 RSD分别为0.96%、0.47%、2.85%、1.64%。

2.2.5 回收率试验 准确称取7号样品粗粉约2 g，精密加入芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素混标溶液0.5 mL、1.0 mL，一式3份，按样品溶液制备方法进行提取，以同样色谱条件分别进样20 μL，芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均回收率分别为101.6%，99.7%，103.2%，99.9%，RSD分别为1.32%、0.99%、3.01%、1.56%。

2.2.6 样品测定 对照品、样品图谱见图1、2。结果见表2。

图1 对照品的HPLC色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substances

3 讨论

图2 样品的HPLC色谱图Fig.2 Chromatogram of sample（No.1）

3.1 不同产地柴胡饮片 （根和茎）中4种黄酮含量 柴胡是常用的中药，以柴胡为君药生产的中成药多达几十种［10］，而柴胡又分布广泛，不同产地的药材其质量的稳定性就显得非常重要。从实验数据可看出，测定的11个不同产地和批次的样品中，芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量有着明显的差异，最低为来自河北的样品，仅为0.166 mg/g，其次是来自南阳的样品，为0.237 mg/g；而总量最高的为来自内蒙古的样品，为2.085 mg/g，其次为来自禹州的一个样品，为1.903 mg/g，这个结果与韦英杰等［9］的结果是一致的。来自同一个产地不同批次的样品其4种黄酮的总量也存在较大的差异，来自禹州的两批样品的芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量分别为1.903 mg/g和0.547 mg/g；来自洛阳两个批次样品的芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量分别为0.976 mg/g和0.538 mg/g。4种黄酮成分在样品中的分布也没有规律，来自内蒙古的柴胡样品中4种黄酮量高达2.085 mg/g，但仅含有山柰素一种黄酮；芦丁在来自洛阳的两个批次中量分别为0.578 mg/g和0.047 mg/g。因此，柴胡的黄酮总量表现出一定的地域性，也存在差异性。从表2还可以看出，收集的南柴胡样品总黄酮量分别为0.331和0.354 mg/g。究其原因是柴胡在我国分布广泛，目前种植柴胡种子来自野外收集，存在严重的种内和种间类型混杂的现象，柴胡又属于异花授粉，因此个体间差异明显。要想保证柴胡药材质量的稳定性和有效性，有必要收集柴胡种质资源，开展杂交育种研究，培育优良品种，开展药材生产管理规范（GAP）。

表2 柴胡样品中4种黄酮测定结果Tab.2 Source of Bupleurum chinense samples and contents of four flavonoids

3.2 根、茎、根和茎混品4种黄酮类成分的量药典规定柴胡的药材为柴胡的根，但市场上的药材往往是根和5～10 cm茎的混品入药。本研究测定了两个产地根、茎和根和茎混合品的4种黄酮的量，茎的总黄酮量最高，分别为0.973 mg/g和1.614 mg/g，根的总黄酮量最低，本别为0.13 mg/g和0.443 mg/g，其混合品的量介于二者之间，分别为0.774 mg/g和0.976 mg/g。总之，茎的存在使柴胡黄酮含量提高。

3.3 叶、茎、茎叶混合品的4种黄酮类成分的量与传统的药用部位相比，叶片、茎和茎叶混合品的4种黄酮总量要明显高出很多，分别为15.667 mg/g、10.034 mg/g和12.557 mg/g。传统药用部位最高仅为2.085 mg/g。还可以看出，叶片中4种黄酮总量最高，茎最低，混合品介于二者之间。比较与根紧密相连的茎和叶片中的茎，可以发现，叶片中的茎含量明显要高。总之，就黄酮量分析叶片和茎的含有量要高于传统使用的根。小叶黑柴胡传统的入药部位也是根，刘秀芳等［11］研究认为小叶黑柴胡茎叶总黄酮具有很好的抗氧化活性；詹雪晶等［12］研究认为柴胡茎叶总黄酮对四氯化碳 （CCl4）所致小鼠急性肝损伤的保护作用。很有必要对茎、叶进行进一步的研究，探讨其替代根的可能性，扩大柴胡用药部位，保护野生资源。

［1］茅仁刚，林东昊，王智华，等.HPLC法测定不同品种柴胡中的柴胡皂苷a、c、d的含量［J］.中草药，2002，23（5）：412-414.

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Determination of four flavonoids in different parts of Bupleurum chinense by HPLC

YUAN Wang-jun1， ZHANG Wei-rui1， WU Hong-xin2， XUE Kui-ling1， LI Mian1*
（1.Institute of Chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China；2.College of Life Sciences，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Bupleurum chinenseDC.；HPLC；root；stem；leaf；flavonoid

R284.1

A

1001-1528（2013）04-0797-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.038

2012-05-10

国家自然科学基金 （30971076）

袁王俊 （1972—），男，讲师，研究方向：中药资源。E-mail：yuanwangjun@henu.edu.cn

*通信作者：李 勉 （1954—），女，高级实验师，研究方向：中药鉴定。E-mail：limian0378@163.com