小强度跑台运动对小鼠空间学习记忆及海马糖原合成酶激酶-3β的影响①

刘慧莉，赵刚

·基础研究·

小强度跑台运动对小鼠空间学习记忆及海马糖原合成酶激酶-3β的影响①

刘慧莉，赵刚

目的 观察小强度跑台运动对小鼠空间学习记忆能力及海马糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白及基因表达的影响。方法3月龄雌性C57BL/6J小鼠24只，分为运动组(n=12)与对照组(n=12)。5个月后行Morris水迷宫测试及GSK-3β检测。结果运动组小鼠逃避潜伏期短于对照组(P＜0.05)，寻找平台路径长度短于对照组(P＜0.05)，穿环次数多于对照组(P＜0.05)；运动组小鼠GSK-3β mRNA表达水平低于对照组(P＜0.05)，p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值高于对照组(P＜0.05)。结论小强度跑台运动可提高小鼠空间学习和记忆能力，降低GSK-3β活性可能是其健脑作用的分子机制之一。

跑台运动；空间学习记忆功能；糖原合成酶激酶-3β；小鼠

[本文著录格式]刘慧莉，赵刚.小强度跑台运动对小鼠空间学习记忆及海马糖原合成酶激酶-3β的影响[J].中国康复理论与实践,2013,19(11):1016-1019.

运动作为中枢神经系统有效的刺激形式，能够促进大脑的功能重组和代偿。众多研究表明，规律运动能提高认知功能[1-4]。运动形式是影响运动效果的重要因素之一。啮齿类动物实验研究中最常采用的运动形式为跑台运动及跑轮运动，跑台运动作为一种被动运动形式，能准确限定运动强度、时间、频度，更接近于人类运动处方的执行模式。

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是参与糖代谢的主要限速酶之一，可使糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成。除参与糖代谢调节外，GSK-3还参与细胞增殖、分化和凋亡等。GSK-3主要有两种亚型：GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β在整个中枢神经系统中都有表达，特别在海马表达水平更高[5]。研究显示，GSK-3β参与海马突触可塑性的调节[6-7]。海马中GSK-3β的激活与记忆的形成相关[8]。

本研究观察小强度跑台运动对C57BL/6J小鼠空间学习记忆能力及海马组织中GSK-3β蛋白表达及基因表达的影响，为制定运动处方提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3月龄雌性C57BL/6J小鼠24只，由中国医科大学实验动物中心提供。常规分笼饲养，每笼4只，自由进食和饮水。每天光照12 h。饲养室温度22～24℃，相对湿度40%～60%。实验动物饲养及取材遵守实验动物管理和保护的有关规定。

1.1.2 主要药品及试剂 兔抗GSK-3β抗体、羊抗p-GSK-3β(Ser9)抗体：美国SANTA CRUZ BIOTECH-NOLOGY公司；实时逆转录聚合酶链反应(Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)试剂盒：SYBR Premix Ex TaqTM，Ta-KaRa大连宝生物工程有限公司；RT-PCR引物由Ta-KaRa大连宝生物工程有限公司设计合成。

1.1.3 主要仪器设备 小动物跑台、Morris水迷宫：淮北正华生物仪器设备有限公司；超速低温离心机：德国Heraus-Biofuge-Primo®；UV-260紫外分光光度计：日本岛津公司；电泳仪、转印槽：上海天能科技有限公司；BIO-RAD凝胶成像分析系统：美国BIO-RAD公司；LightCycler 48ⅡPCR仪：瑞士Roche公司。

1.2 实验方法

小鼠分为对照组和运动组，每组12只。

运动组进行跑台适应性训练2 d，第1天5 m/min运动10 min，第2天8 m/min运动10 min。第3天开始正式运动，每天14:00后进行跑台运动30 min：5 m/ min运动5 min，8 m/min运动5 min，11 m/min运动20 min。这一运动强度约为45%～55%最大摄氧量(VO2max)[9]。

每天运动结束后放回饲养笼中，自由进食饮水。每周运动5 d，休息2 d，持续5个月(从3月龄至8月龄)。所有动物均顺利完成运动方案。

对照组置于静止跑台上，与运动组时间相同。

1.3 Morris水迷宫测试

5个月运动训练后进行Morris水迷宫测试[10]。Morris水迷宫由圆形水池(直径120 cm，高60 cm)、站台(直径8 cm)、影像追踪系统构成，水深约30 cm，水中加入无毒的食用白色素，使池水浑浊呈乳白色，水温维持在24℃。池壁标明“E、S、W、N”4个入水点，将水池等分为4个象限，平台置于第Ⅳ象限中央。水池上方摄像头与计算机相连，用ZH0065 Plus Image Analyzer记录实验过程中小鼠的运动行为。正式实验开始前1 d，予小鼠适应性游泳训练。

整个实验过程分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验包括可视平台实验1 d和隐蔽平台实验6 d，实验过程中，平台位置保持不变。最后一次隐蔽平台实验结束24 h后进行空间探索实验。

可视平台实验中，平台超过水面0.5 cm，分别将小鼠从4个不同的入水点面向池壁投入水中，小鼠寻找平台。当小鼠爬上平台或时间到达60 s时，停止实验。如果60 s内小鼠没有找到平台，则实验者引导其爬到平台上，并让其停留10 s。

隐蔽平台实验中，平台低于水面0.8 cm，每天分别从4个象限入水，随机选取第1次入水的象限，连续6 d，方法与可视平台实验相同。每次间隔5～15 min。

通过影像跟踪系统记录小鼠寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期(escape latency)和路程即路径长度(path length)，并根据小鼠在水中搜索平台的游泳轨迹确定其每次的搜索策略。

空间探索实验时，撤去水中平台，把小鼠从第Ⅱ象限投入水中，记录120 s内小鼠通过平台位置的次数(cross times)和搜索平台的游泳轨迹。

1.4 组织取材

Morris水迷宫实验结束1周后取材。所有小鼠断头取脑，剥离海马，一半海马快速投入液氮速冻，-80℃冰箱保存，待行Western blotting检测。另一半加入Trizol，-80℃冰箱保存，待行RT-PCR。

1.5 Western blotting

取冷冻的小鼠海马组织称重，小剪刀剪碎样品(冰上操作)，1∶4加入蛋白裂解液，超声粉碎，4℃裂解过夜，4℃12000 r/min低温离心30 min，取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，每管50 μg蛋白分装，-80℃冻存待用。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，4℃转膜过夜，5%BSA溶液室温封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL发光，凝胶图像分析系统采图、分析。

1.6 RT-PCR

总RNA提取：取出冻存的海马组织，充分匀浆(冰上操作)，裂解组织细胞后，将匀浆液移至1.5 ml离心管中。加入氯仿200 μl，振荡15 s，室温孵育2～3 min，4℃12000 r/min离心15 min，取上清；加入等体积异丙醇，充分混匀，室温孵育10 min，4℃12000 r/min离心10 min，弃上清；加入75%DEPC水配制的乙醇1 ml，轻轻洗涤管壁，4℃12000 r/min离心5 min，弃上清；室温干燥，加入DEPC水50 μl，将沉淀溶解；吸取20 μl总RNA样品，紫外分光光度计测260 nm及280 nm吸光度值，检测提取RNA的质量及产量。剩余样品-80℃冰箱保存。

cDNA合成：取总RNA 1 μl，配置成cDNA合成反应液10 μl(含5x PrimeScript Buffer 2 μl，Prime-Script RT Enzyme Mix I 0.5 μl，50 μmol/L Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6mer 0.5 μl，RNase free dH2O 5.5 μl)，37℃孵育15 min，85℃终止反应5 s，4℃保持，-20℃长期保存。

PCR扩增：反应体系20 μl(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μl，10 μmon/L PCR Forward Primer 0.8 μl，10 μmon/L PCR Reverse Primer 0.8 μl，cDNA溶液2 μl，dH2O 6.4 μl)，反应条件：初始循环，95℃5 min；扩增循环，95℃15 s，55℃15 s，72℃45 s，共40个循环；绘制溶解曲线：95℃15 s，60℃ 1 min，缓慢加热到95℃15 s。

引物序列：

根据标准曲线，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果，实时RT-PCR结果以Ct值表示，即PCR反应指数增长初期荧光信号跨越阈值时的反应循环数。相对定量采用比较Ct法：以β-actin基因为管家基因，ΔCt为目的基因和管家基因的Ct值差。ΔΔCt表示对照组与处理组间的ΔCt差异。

1.7 统计学分析

图1 隐蔽平台实验两组逃避潜伏期

图2 隐蔽平台实验两组寻找平台路径长度

采用SAS 8.1统计软件进行统计分析。实验数据以(±s)表示，组间比较采用方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

可视平台实验中，小鼠的逃避潜伏期对照组为(56.34±8.62)s，运动组为(55.67±6.58)s，无显著性差异(F=0.43,P=0.5134)；路径长度对照组为(842.59± 138.16)cm，运动组为(823.78±113.67)cm，无显著性差异(F=1.25,P=0.2665)。

隐蔽平台实验中，两组小鼠搜索平台的逃避潜伏期和寻找平台路径长度均呈下降趋势(图1、图2)。从第3天开始，运动组逃避潜伏期显著短于对照组(F= 21.54,P=0.0001)；从第4天开始，运动组寻找平台路径长度显著短于对照组(F=95.21,P=0.0001)。

空间探索实验中，运动组通过平台位置(6.78± 1.88)次，明显多于对照组(3.94±1.45)次(F=13.75,P= 0.0012)。

2.2 RT-PCR

溶解曲线只显示一个主波峰，表明PCR扩增的特异性较高，符合荧光定量PCR的技术要求。扩增曲线分析显示样本扩增效率良好。

运动组GSK-3β mRNA表达的ΔΔCt为(0.5601± 0.2152)，明显低于对照组(-0.0014±0.2352)(F=18.61,P=0.0015)。

2.3 Western blotting

运动组p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值较对照组显著升高(F=232.37,P=0.001)。见图3。

图3 两组p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值

3 讨论

跑台训练常常使用电刺激等手段，被认为是一种被动运动形式，可能会引起训练动物的精神刺激，产生不良后果，因而很多实验者采用主动运动的跑轮进行研究。但在实际制定运动处方中，我们经常需要限定运动强度、运动时间、运动频度等，来保证处方的安全性和有效性，这是跑轮运动无法代替的。本实验采用小强度跑台运动，在整个训练过程中，小鼠轻松完成运动方案，并未使用电刺激等强迫运动手段。我们认为这种运动更接近人类的运动处方形式。

本研究显示，经过5个月的小强度跑台运动，小鼠的空间学习记忆能力增强，与以往研究结果一致[1-4]。

作为GSK-3的一个亚型，GSK-3β在整个中枢神经系统中都有表达。海马中GSK-3β的激活与记忆的形成相关[8]。

GSK-3活性受多种机制调节，磷酸化是研究最多的调节方式之一。GSK-3β-Ser9和GSK-3β-Tyr216的磷酸化修饰是机体对GSK-3β活性调控的关键过程，磷酸化GSK-3β的Ser9可以导致其失活[12]。与之相反的是磷酸化GSK-3β的Thr216则能够增加此酶的活性。我们利用p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值反映GSK-3β的活性，p-GSK-3β-Ser 9/GSK-3β比值下降表示GSK-3β的活性升高[13]。

研究显示，小强度跑台运动抑制GSK-3β活性。实时定量RT-PCR结果也显示，小强度跑台运动使C57BL/6J小鼠GSK-3β mRNA表达水平降低。此前研究显示，GSK-3β参与调控长期跑台运动对小鼠学习和记忆的影响[14]，与本研究一致。

本研究显示，5个月小强度跑台运动能提高小鼠的空间学习记忆能力，同时伴有GSK-3β基因表达与蛋白表达降低。两者之间可能存在一定联系，需要进一步研究。本实验采用的运动处方对于健脑运动处方的制定有一定参考意义。

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Effects of Low Intensity Treadmill Training on Spatial Learning and Memory and Expression of Glycogen Synthase Kinase-3β in Hippocampus in Mice

LIU Hui-li,ZHAO Gang.Department of Sport Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,Liaoning, China

ObjectiveTo investigate the effects of low intensity treadmill training on spatial learning and memory and expression of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)in hippocampus in mice.Methods24 female C57BL/6J mice of 3 months were assigned into control group(n=12)and exercise group(n=12).They were assessed with Morris Water Maze task 5 months after exercise.The GSK-3β protein and mRNA expressed in hippocampus were determined 1 week after the task.ResultsThe latency and path length to escape onto the hidden platform decreased in the exercise group(P＜0.05),while the cross times increased(P＜0.05)compared with the control group.The level of GSK-3β mRNA decreased(P＜0.05)and ratio of p-GSK-3β-Ser9 to GSK-3β increased(P＜0.05)as well.ConclusionLow intensity treadmill exercise may improve the spatial learning and memory in mice,which may down-regulate the expression and activity of GSK-3β.

treadmill exercise;spatial learning and memory;glycogen synthase kinase-3β;mice

R455

A

1006-9771(2013)11-1016-04

2013-04-08

2013-04-24)

国家自然科学基金(No.31100857)。

中国医科大学运动医学系，辽宁沈阳市110001。作者简介：刘慧莉(1977-)，女，黑龙江伊春市人，博士，副教授，主要研究方向：运动与学习和记忆。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.005