血必净对大鼠多脏器功能障碍综合征炎性因子的影响

陆 璐，冯小明，王红义，牛廷献，万东君，王春雨，罗晓红

(兰州军区兰州总医院 1.动物实验科，2.内分泌科，3.干部病房，兰州 730050)

多脏器功能障碍综合征(MODS)是严重感染、休克或创伤后导致的严重并发症，病死率高达60%～98%［1］。它具有发病急、进展快、病死率高的特点，是 ICU患者最重要的死亡原因［2］。血必净(XBJ)具有拮抗内毒素、抗炎、改善免疫功能、保护组织细胞的作用［3］。目前已发现的细胞因子有30多种，其中介导MODS炎症反应的细胞因子通常被称为炎性细胞因子，根据其功能可以分为两大类，即促炎细胞因子和抗炎细胞因子。TNF－α和 IL－1是炎症反应出现最早且最为重要的促炎细胞因子，而IL－4和IL－10是很重要的抗炎细胞因子。本研究利用 LPS建立大鼠 MODS模型，以探讨 XBJ对MODS炎性因子的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

90只SPF级Wistar大鼠(北京实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(京)2009－0017;实验动物使用许可证号:SYXK(军)2009－022);全价饲料饲养，饲料合格证号:SCXK(京)2009－0017，雌雄各半，体重(200±20)g，随机分为对照组、模型组和XBJ组，每组30只。

1.2 模型建立

采用大鼠固定器将其固定好，尾静脉以15 μg/(kg·bw)注射内毒素(LPS)(血清型为:O127﹕ B8，批号为 64H4010，美国 Sigma公司)构建 MODS模型。

1.3 干预方法

XBJ组在造模前 24 h以 10 mL/(kg·bw)的剂量腹腔注射XBJ(天津红日药业股份有限公司，国药准字:Z20040033)，对照组与模型组以等剂量的葡萄糖腹腔注射。实验时，采用大鼠固定器将其固定好，对模型组与 XBJ组通过尾静脉注射 LPS构建MODS大鼠动物模型。XBJ组以2次/d腹腔注射XBJ，每次 10 mL/(kg·bw)，连续注射 3d，同时对照组与模型组以等剂量的葡萄糖腹腔注射。在整个试验期间，每隔2 h观察大鼠的体征变化。

1.4 血清收集

分别于 LPS 注射后 0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h，每组每个时间点各取5只大鼠，乙醚全身麻醉后，经心脏采血，分离血清，－20℃保存备用。

1.5 ELISA方法检测各项指标

TNF－α、IL－4、IL－1α 和 IL－10 ELISA 检测试剂盒均由达科为生物公司生产。其具体检测方法见试剂盒操作说明书。

1.6 MODS的诊断标准

参照胡森等［4］提出的动物发生 MODS时各个器官功能障碍分期诊断标准和评分标准。在注射LPS后出现2个或2个以上器官或系统功能障碍判定为 MODS。

1.7 数据处理与统计

数据以均数 ±标准差表示，利用 SPSS 17.0统计分析软件对数据进行处理，两组之间比较采用 t检验，组内比较采用方差分析。

2 结果

2.1 体征表现及死亡率

模型组经尾静脉注射LPS 6 h后，大鼠出现躁动，口唇紫绀，呼吸急促，心率加快，体温升高，部分口鼻由粉红色泡沫状液体溢出，同时所有大鼠开始扎堆。12～24 h，大鼠变化为蜷缩少动，被毛竖立，呼吸窘迫，紫绀加重，食欲下降，尿液呈深褐色，粪便稀。48～72 h逐渐恢复趋于正常。濒死的大鼠呼吸减慢，心率缓慢，对刺激反应减弱。XBJ干预组大鼠在6 h出现同样症状，但是其症状要稍微缓和一点，且口鼻没有溢出粉红色泡沫状液体，并且在12 h后开始缓慢恢复，24 h后个别大鼠开始有饮食迹象，48 h干预组大鼠基本恢复正常。

对照组:没有出现死亡。模型组:6 h后，4只大鼠心衰死亡，12 h后又有5只死亡，24 h后最后2只也相继死亡，所剩大鼠在48 h后开始慢慢恢复，72 h后基本恢复正常。XBJ干预组:6 h后，3只大鼠因呼吸窘迫、心衰死亡，12 h后又有3只死亡，所剩大鼠24 h后开始逐渐恢复正常。对照组、模型组和XBJ干预组的死亡率分别为:0、37%和20%。结果表明:XBJ能缓解LPS对大鼠 MODS模型的脏器的损伤，有效缓解动物的体征表现，同时降低死亡率。

2.2 促炎因子 TNF-α、IL-1α检测结果

TNF－α、IL－1α ELISA 检测结果见表 1。TNF－α在注射LPS后表达水平开始升高，模型组在6～24 h的表达水平与对照组相比有明显的升高，在12～24 h与0 h相比有明显的升高(P＜0.05)，XBJ组的TNF－α表达水平相对模型组较高且与对照组相比有明显的升高(P＜0.05)，并在6～24 h时有非常显著的升高(P＜0.01)，只有在24 h时与0 h以及对照组相比有显著的升高(P ＜0.05)，在 12h TNF－α 的表达量和0 h相比有显著的升高(P＜0.05)。模型组IL－1α的表达水平普遍高于对照组，并在12～24 h与0 h以及对照组相比有明显的升高(P＜0.05)，XBJ组IL－1α的表达水平与0 h以及对照组相比普遍降低，并在0～6 h其表达水平明显低于相应的对照组，且有统计学意义(P＜0.05)。值得一提的是XBJ在此实验中明显的促进了 TNF－α的表达，但在有效抑制了IL－1α的表达。

表1 血清TNF－α、IL－1α ELISA检测结果(±s)Tab.1 The results of TNF－α、IL－1α of serum by ELISA

表1 血清TNF－α、IL－1α ELISA检测结果(±s)Tab.1 The results of TNF－α、IL－1α of serum by ELISA

注:* 与0 h相比 p ＜ 0.05，＊＊与0 h相比 p ＜ 0.01;△与对照组相比 p ＜ 0.05，△△与对照组相比 p ＜ 0.01。Note:*vs 0 h p ＜ 0.05，＊＊vs 0 h p ＜ 0.01.△vs control group p ＜ 0.05，△△vs control group p ＜ 0.01.

0.47 ± 0.13 0.51 ±0.12 0.48 ±0.16 0.41 ±0.14对照组(control) 0.29 ±0.07 0.25 ±0.06 0.33 ±0.08 0.27 ±0.06 0.24 ±0.07 0.23 ±0.05 TNF－α 模型组(model) 0.32 ±0.06 0.46 ±0.14△ 0.61 ±0.12＊△ 0.53 ±0.17＊△ 0.49 ±0.15 0.37 ±0.13 XBJ组(XBJ) 0.67 ±0.18△ 0.95 ±0.19＊△△ 0.98 ±0.21＊△△ 0.74 ±0.12△△ 0.63 ±0.13△ 0.58 ±0.16△对照组(control) 0.57 ±0.13 0.61 ±0.25 0.56 ±0.23 0.62 ±0.17 0.55 ±0.21 0.53 ±0.14 IL－1α 模型组(model) 0.67 ±0.21 0.76 ±0.13 0.71 ±0.22＊△ 0.88 ±0.24＊△ 0.71 ±0.26 0.64 ±0.19 XBJ组(XBJ) 0.36 ±0.12△ 0.45 ±0.18△

表2 血清IL－4、IL－10 ELISA检测结果(±s)Tab.2 The results of IL－4、IL－10 of serum by ELISA

表2 血清IL－4、IL－10 ELISA检测结果(±s)Tab.2 The results of IL－4、IL－10 of serum by ELISA

注:*与0 h相比 p ＜ 0.05，＊＊与0 h相比 p ＜ 0.01;△与对照组相比 p ＜ 0.05，△△与对照组相比 p ＜ 0.01。Note:*vs 0 h p ＜ 0.05，＊＊vs 0 h p ＜ 0.01.△vs control group p ＜ 0.05，△△vs control group p ＜ 0.01.

对照组(control) 0.25 ±0.11 0.23 ±0.08 0.27 ±0.12 0.29 ±0.07 0.22 ±0.06 0.25 ±0.09 IL－4 模型组(model) 0.31 ±0.06 0.48 ±0.13＊△ 0.51 ±0.17＊△ 0.46 ±0.08△ 0.38 ±0.13 0.36 ±0.07 XBJ组(XBJ) 0.36 ±0.15 0.41 ±0.06△ 0.45 ±0.08△ 0.39 ±0.13 0.32 ±0.06 0.35 ±0.11对照组(control) 0.44 ±0.13 0.42 ±0.15 0.45 ±0.08 0.48 ±0.14 0.43 ±0.12 0.46 ±0.17 IL－10 模型组(model) 0.50 ±0.17 0.81 ±0.21＊△ 0.73 ±0.12＊△ 0.67 ±0.16△ 0.66 ±0.18△ 0.52 ±0.13 XBJ组(XBJ) 0.56 ±0.08 0.68 ±0.17△0.57 ± 0.18 0.59 ±0.13 0.48 ±0.11 0.46 ±0.06

2.3 抗炎因子IL-4、IL-10检测结果

IL－4、IL－10 ELISA 检测结果见表 2。模型组 IL－4的表达水平在6 h之后表达水平开始上升，并且在6～12 h与0 h和对照组相比有明显的升高(P＜0.05)，在24 h的表达水平与对照组相比有明显的升高(P＜0.05);XBJ组在6～12 h与对照组相比表达量明显升高具有统计学意义(P＜0.05)，在其他各时点的表达水平相对于0h和对照组变化较小，没有统计学意义(P＞0.05)。模型组 IL－10相对于对照组其表达水平较高，在6～12 h与0 h和对照组相比有明显的升高，在24～48 h与对照组相比有明显的升高(P ＜0.05)，在 72 h开始降低;XBJ组 IL－10的表达水平除了在6h时与对照组相比有明显的升高之外，与0 h和对照组相比变化不明显，没有统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨论

在Wistar大鼠尾静脉注射LPS后出现心跳加速、呼吸急促，6 h后个别大鼠因脏器的严重损伤而死亡，存活下来的大鼠在72 h后逐渐改善。其中模型组的死亡率要高于XBJ组，由此可以看出XBJ可以缓解由LPS所致的大鼠多脏器的损伤。

细胞因子是一个超家族，参与MODS的细胞因子很多，可形成细胞因子网络，其相互作用产生细胞因子级联效应，炎性反应一旦失去控制，组织器官受损发展为 MODS［5－7］。TNF被认为是最重要的促炎因子，循环中高滴度TNF与猛烈的炎性反应及SIRS/MODS的发生密切相关。在炎性反应过程中，这些因子最初由吞噬细胞/内皮细胞表达在其细胞膜上，然后由于血流剪切力或酶的作用而释入循环中，它们的作用主要与炎性反应的进一步扩大和吞噬细胞由血流经血管内皮向组织中游走并因而可能造成的组织损伤有关［6，7］。为此，大量的研究集中于拮抗和清除MODS患者体内炎症介质和细胞因子，而临床和动物实验的结果确显示这些疗法的局限和无效。本研究用 XBJ注射液在治疗动物MODS模型过程中对其体内细胞因子和炎性介质的作用。XBJ注射液具有活血化瘀、扶正固本、清热解毒、菌毒并治等功效。在各脏器损伤的治疗中发挥了拮抗内毒素、清除氧自由基［8－10］、保护血管内皮［11，12］、抗炎性介质［13－16］、调节免疫功能［17，18］等作用。对肺损伤的治疗机制:血必净通过抑制中性粒细胞在肺内集聚、过度活化、呼吸爆发，减少氧自由基，从而对急性肺损伤起到一定的保护作用。血必净注射液能够有效改善慢性肺心病心功能不全患者的血液流变性，提高 PaO2、降低 PaCO2，改善呼吸状态，改善心脏收缩功能［19］。当机体在 SIRS状态下炎症介质过量释放和炎症细胞过度激活，并通过内毒素、细胞因子、缺血再灌注损伤与微循环障碍等各种途径引发MODS。血必净注射液通过大量动物实验以及临床验证，均证明能够有效地拮抗内毒素，抑制肿瘤坏死因子的失控性释放，清除体内炎症介质［20－22］;同时因其活血化瘀的作用，能改善微循环，增加血流量，减少血小板的黏附聚集，降低急性炎症时毛细血管的通透性，减少炎症渗出，改善局部的血液循环，促进炎症的吸收，从而促进病变部位的修复和痊愈。

MODS不仅有炎症介质过度释放，而且伴有内源性抗炎介质的释放异常［23］。本实验大鼠经注射LPS 后，血清中 TNF－α、IL－1α 和 IL－4、IL－10 值均有不同程度的升高，并且其变化规律也是在6 h开始上升，在12～24 h基本达到最高点，然后开始降低;XBJ干预组 IL－1α、IL－4 和 IL－10 的值明显低于模型组，变化的幅度及恢复的时间均小于模型组，这说明 XBJ可有效的抑制 IL－1α、IL－4 和 IL－10 抗、促炎因子的骤变，对抗、促炎因子起平衡调节作用，这与动物的体征变化结果相吻合。TNF－α和 IL－1是炎症反应出现最早且最为重要的促炎细胞因子，TNF－α是单核巨噬细胞在内毒素、炎症介质等的作用下生成的一种多肽，主要参与机体炎症过程和免疫过程［24］，TNF－α 在免疫应答效应阶段，能够活化巨噬细胞、中性粒细胞，增强其吞噬、杀伤等活性，通过与T淋巴细胞表面受体结合调节 TNF－α介导的胞内信号转导，从而活化T淋巴细胞并促进大量促炎细胞因子的产生。本研究结果显示LPS可刺激TNF－α、IL－10 等促、抗炎细胞因子在 6 ～24 h 大量集中释放，此后在72 h开始回落。IL－4是由单核细胞、淋巴细胞产生和释放的抗炎细胞因子，能够抑制LPS诱导的炎性细胞因子产生［25］。虽然 IL－4可抑制 TNF－α、IL－1 等炎症介质的合成［26］，在本实验中因为 IL－4的表达量相对较低，所以在抑制 TNF－α、IL－1α的表达上并不明显。本研究显示 IL－10的表达水平在LPS的刺激下持续显著增高，但是XBJ可有效的抑制其增高。IL－10作为抗炎细胞因子中很重要的一员，主要由巨噬细胞及白细胞介素分泌，能下调Th1型细胞因子的表达，是一种强有力免疫抑制因子和协调刺激分子。与其他细胞因子不同的是，IL－10除了能一定程度地促进细胞毒性T细胞诱导、增强B细胞增殖分化外，其主要生物学活性是起免疫抑制作用，它能抑制Th1细胞的增殖及IL－2、IL－3、IFN－α、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子的合成，故其免疫调节作用依靶细胞不同而表现出双向性。在本研究中 XBJ明显促进了TNF－α 的表达，抑制 IL－1α 和 IL－4、IL－10 的表达，这可能正是XBJ对炎性因子所起到的微观平衡调节作用。

细胞因子的作用是一把双刃剑，高表达有利于病毒清除，同时也可导致持续的炎性反应。MODS病理过程中，促炎、抗炎因子起着不同的作用。两者相互制约，相互转化，对立平衡。钟起诚认为，中医的阴阳平衡包括现代免疫学的功能亢进与缺陷、致炎与抗炎、吞噬与被吞噬、抑制与抗抑制的过程［27］。现代医学的免疫学中的免疫应答机制、免疫反应的调节功能，也是说明通过机体的细胞、体液的反映过程，使机体相对的平衡。如果平衡失调均会产生疾病，在疾病过程中免疫系统的变化，似乎也与阴阳的变化颇相吻合。在MODS发生发展中，免疫病理损伤贯穿始终，如果促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间彼此取得平衡，则内环境稳定得以保持。否则，将出现过度抗炎性反应，当炎性反应占主导时，则发生组织细胞损伤、器官功能障碍，当抗炎性反应过强时，则出现免疫功能抑制。本研究中XBJ在炎性因子的免疫调节中起到平衡调节的作用，从而有效的缓解和保护MODS对大鼠多脏器的损伤。

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