DEN诱发PLCε基因敲除小鼠肝癌模型的建立

崔 智，李瑞生，李晓娟，胡 燕，戴广海，白云峰

(1.解放军总医院肿瘤综合治疗科，北京 100853;2.解放军第302医院实验技术保障中心，北京 100039)

原发性肝癌(简称肝癌)是由肝细胞或者胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，全世界每年死于肝癌的患者大约26万人，其中我国占42.5%。由于药物治疗效果欠佳，因此深入阐明肝癌的致病机理对于开发新的药物治疗靶点具有十分重要的意义。磷脂酶 C epsilon(pnospholipase C epsilon，PLCε)为1998年日本神户大学的片冈彻(Kataoka T)教授［1］在秀丽隐杆线虫中发现，该研究组还发现PLCε是癌基因产物Ras及抑癌基因产物 Rap的新效应蛋白［2］。2003年Kataoka实验室采用基因打靶法成功建立了 PLCε敲基因鼠，通过皮肤化学诱癌法(DMBA，TPA 二阶段诱癌方案)发现 PLCε－/－小鼠的乳头瘤发生频率明显下降，并且它的恶性进展也被明显抑制，从而确立了PLCε在皮肤癌变过程中的重要作用［3］，Ikuta 等［4］进一步证明了 TPA 介导PLCε的活化而诱发炎症，导致肿瘤的形成。本实验拟采用突变诱发剂二乙基亚硝胺和肿瘤增强剂苯巴比妥诱发 PLCε敲基因型(PLC－/－)和野生型(PLC+/+)小鼠来建立肝脏肿瘤动物模型，以了解PLCε基因敲除鼠的抗癌特性，从而来分析其肝癌的发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

PLCε基因敲除鼠采用基因打靶法做成，已对基因敲除鼠进行了形态观察及分子生物学鉴定，以确认基因缺损鼠丧失PLC活性，由日本引进到解放军第302医院动物实验中心进行实验研究，随机选取新生 PLCε－/－(敲基因型)和 PLCε+/+(野生型)雄性小鼠各80只，单鼠体质量6～8 g，动物实验环境为SPF级，实验动物使用许可证【SYXK(军)2007-010】。

1.2 化学致癌剂配制

DEN(淡黄色液体，Sigma公司提供，货号 N-0258);PB(恒业中远化工有限公司提供25g/瓶，批号110927)。

1.3 实验分组及肝癌诱导

将出生后6周小鼠剪尾取血提取DNA，用RTPCR法进行基因型鉴定获得 PLCε+/+(野生型)，PLCε+/－(杂合子)和 PLCε－/－(敲基因)等三种基因型［5］。选取 PLCε+/+与 PLCε－/－小鼠各 25 对入组，分别进行野生型与野生型、敲基因型与敲基因型自交繁殖，出生后 12日龄时从 PLCε－/－型和PLCε+/+型中随机选取雄性小鼠各80只，其中:40只 PLCε－/－鼠入实验组Ⅰ，40 只 PLCε－/－鼠入对照组Ⅰ，40只 PLCε+/+鼠入实验组Ⅱ，40只 PLCε+/+鼠入对照组Ⅱ。对照组Ⅰ、Ⅱ正常给予饲料及饮水，实验室温度控制在20～25℃，湿度控制在40%～70%。实验组Ⅰ、Ⅱ给予腹腔注射 DEN10μg/(g·bw)［3］，注射后给予正常饲料及饮水，待4周龄后采用浓度为0.05%PB［3］饮水，一周后改为0.06%PB饮水。每天观察试验鼠的精神、饮食、毛色、粪便等情况，24周后取肝脏。计算出小鼠的存活率和诱癌成功率，存活率 =每组存活的小鼠数/各组小鼠总数×100%，诱癌成功率=诱癌成功小鼠数/各组小鼠数×100%。

1.4 病理标本的收集和处理

采取脱臼法分别处死实验组及对照组小鼠，打开腹腔，迅速取出肝脏称重，观察肝脏颜色、大小、质地及有无癌变结节。取肉眼观察到有病变的组织放入4%甲醛溶液中固定24～48 h，再用酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋和切片后进行 HE染色，最后拍照保存。

2 结果

2.1 实验小鼠的存活数及存活率

实验期间，由于致癌剂的毒性作用，实验组小鼠从第3周开始出现精神萎靡，活动和饮食水量减少以及背部出现脱毛等现象，从第5周开始野生型和敲基因型实验组分别出现死亡，至第24周时野生型实验组小鼠存活 30只，死亡 10只，存活率为75%，野生型对照组小鼠存活 40只，其存活率为100%;敲基因型实验组小鼠存活32只，死亡8只，存活率为80%，敲基因型对照组小鼠成活40只，成活率为100%。其具体情况见表1。

2.2 实验小鼠肝脏肉眼观察

诱癌24周时，解剖后肉眼观察，各实验组小鼠肝脏体积和重量均增大，颜色黯淡，绝大部分表面可见灰白色结节，肿块大体观察:切面呈灰白色鱼肉状，无明显坏死或出血改变，与周围正常肝组织分界较清晰，其中野生型实验组小鼠肝脏及腹膜上可见多发小结节状转移灶(见图1，彩插2)。敲基因型实验组小鼠绝大部分不能肉眼看到肝脏结节，但肝脏体积增大，少部分表面可见灰白色结节。而两个对照组小鼠的肝脏均呈现光滑无病变(见图2，彩插2)。

表1 各实验组小鼠的存活数及存活率分析Tab.1 Number of the mice survived in each experimental group and survival analysis

2.3 实验小鼠病理分析及诱癌成功率

两组实验组病理所见:瘤细胞呈实性巢状，局灶见坏死，瘤细胞异型性明显，胞浆丰富，嗜酸性，核圆形，核仁清楚，核分裂像多见。瘤细胞间可见裂隙样血管，肿瘤与周围正常肝组织分界较清楚，并可见畸形的瘤巨细胞，部分瘤细胞围绕血管生长，局部见瘤细胞侵犯血管壁(见图3和4，彩插2)。野生型实验组成活的30只小鼠病理分析提示有18只诱发肝癌成功，其诱癌成功率达60%;敲基因型实验组成活的32只小鼠病理分析提示有15只诱发肝癌成功，其诱癌成功率达46.9%。

3 讨论

目前复制肿瘤诱发动物模型的诱发剂种类较多，但大多采用高剂量的致癌剂加促癌物混合短期使用或致癌剂的单独长期使用的方法来研究肿瘤的形成［6，7］，其诱变是一个比较复杂的多阶段作用过程，其促癌物可通过长期反复的累积作用促进潜在的肿瘤细胞发生癌变。DEN具有较强的肝脏毒性作用，其作为致癌物与人原发性肝癌在病因学上存在着一定的相似性，其诱发的小鼠肝癌为肝细胞癌，与人的肝癌的发生过程也较为相似。由于其具有较高的成功率和良好的专一性，DEN诱导肝癌模型迄今仍然是应用最为广泛的肝癌模型。如寿旗扬等［8］采用小剂量 DEN诱发 C3H/HeN小鼠，成功地建立了肝癌小鼠模型。而侯敏等［9］还利用乙基亚硝脲(ENU)诱变剂也成功地建立了小鼠肺腺癌模型。苯巴比妥(PB)主要是对肝脏作为其特异性靶器官，它有可能抑制正常细胞因其他因素诱导的细胞凋亡，甚至抑制潜在的癌变细胞的细胞凋亡，使病灶中有基因损伤的细胞存活下来，从而促进了肿瘤的形成［10－11］。实验证明细胞凋亡减少可认为是苯巴比妥重要的促癌途径之一，苯巴比妥可以通过促进细胞增生和抑制细胞凋亡两种途径，来促进癌前细胞增生灶的数量和密度，从而促进肿瘤的形成。事实上，肿瘤的发生正是高细胞增殖率和相对较低的细胞凋亡率共同作用的结果［12］。

PLCε不仅具有 PLC典型的催化结构域(X、Y)、C2结构域同源序列，而且还有特异性的羧基端大鼠肉瘤(rat sarcoma，Ras)相关(ras association，RA)结构域和氨基端 Ras鸟苷交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)结构域，研究证明PLCε被小G蛋白激活，可通过对第二信使有直接反应的调节蛋白控制着Ras鸟苷三磷酸酶(GTPase)，因小G蛋白家族成员绝大部分都是癌基因编码的蛋白，它们在细胞内过度表达或激活与肿瘤的发生发展关系密切，因此推测PLCε在肿瘤的发生发展中起着重要的作用［13］。

本研究采用突变诱发剂(DEN)联合肿瘤增强剂(PB)成功地诱导出小鼠肝癌动物模型，其天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的生化检测值比正常PLCε小鼠检测结果［14］偏高，说明在癌变过程中也会出现炎症反应。而在诱癌过程中实验组小鼠出现死亡，而对照组没有，这可能是由于腹腔注射时的感染、脏器的损伤以及个别小鼠对药物DEN和PB敏感所造成的。结果显示PLCε敲基因型实验组小鼠的成活率高于野生型实验组，诱癌成功率要低于野生型实验组，这可能是由于PLCε基因与肝脏肿瘤发生、发展有一定的相关性。该模型是在致癌因子作用下，通过自身细胞的突变、转化和增殖形成的，这种模型在研究肿瘤的发病机制、组织学和生物学特性以及肿瘤与宿主的相互关系等方面要比移植性肝癌模型更合适更有效［15］。这也为肝脏肿瘤的基因治疗提供了一种新的思路和理论依据。

(本文图 1，2，3，4 见彩插 2 。)

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