基因工程大鼠研究进展

王贵利，张连峰

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

1 简介

实验大鼠，又名挪威大鼠，起源于亚洲，在1700年左右传播到欧洲和美洲。早在1850年之前就被应用于营养学实验，是第一个驯养的用于医学研究的哺乳动物［1］。然而，直到 1856年法国内科医生 J.M.Philipeaux［2］才发表了第一篇利用白化大鼠进行研究的文章。1903年人们发现大鼠的毛色遗传遵循孟德尔遗传规律。同时，大鼠和小鼠的第一个近交系都诞生于1909年。在一百年间，大鼠在实验动物中处于统治地位，被生理学家、心理学家和生物药物研发者使用。迄今为止，大鼠已有700种不同的封闭群、近交系、突变系和同类系，成为人类疾病和生理特性研究的动物模型［1］。利用PubMed搜索过去50年的非综述文献，发现直到本世纪初，以大鼠为实验材料的文献仍多于小鼠。虽然现在小鼠成为更流行的动物模型，但对许多研究者，包括部分生理学家，行为学家和毒理学家而言，大鼠仍是首选。原因除大鼠体型较大，更适合体内成像、电生理、手术等操作外，还在于大鼠在生理、某些行为、代谢等方面更接近人类。所以大鼠是某些心脑血管疾病研究、毒理学研究、神经学和行为学研究理想的动物模型［3］。并且在部分疾病模型中，转基因大鼠弥补了转基因小鼠的局限性。例如大鼠具有更准确的炎症疾病［4］和包括帕金森［5-7］、亨廷顿氏病［8，9］在内的神经系统疾病表型。转基因亨廷顿氏病大鼠模型不仅具有比小鼠更典型的成人病理表型，而且更适合活体代谢和结构成像分析［8］。此外，在大鼠脑黑质中表达突触核蛋白，可以造成多巴胺神经元的损失，这在小鼠中无法实现［6，7］。

表1 大鼠、小鼠和人类的主要生理数据比较Tab.1 Comparison of major physiological parameters between rat，mouse and human

综上，由于大鼠的特点，在生理、代谢、神经系统、循环系统及学习、认知、记忆和激励某些行为研究，以及药物安全评价等方面，具有比小鼠更好的表现。因此，大鼠在生命科学研究中的作用日趋重要。

虽然以大鼠制作人类疾病研究的动物模型有很多优点，但是大鼠基因工程技术的缺乏严重阻碍了大鼠动物模型的发展。直到2008年，才建立了可用于基因打靶的大鼠胚胎干细胞［10-12］。最近，几个科研小组建立了通过大鼠干细胞进行基因打靶获的技术［13-16］。但是大鼠胚胎干细胞分化和生殖细胞传代效率的低下限制了该技术的应用。随着不依赖于胚胎干细胞的基因修饰技术，包括转座子及逆转座子，锌指酶(zinc finger nucleases，ZFN)和类转录激活因子效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)等技术的不断完善，大鼠基因工程成为实验动物科学的热点，并可以利用这些技术制作大鼠模型。并预测可能基于大鼠基因工程的进展，大鼠进一步发挥其对生物学研究巨大的促进作用，进而发展为“遗传生理学”新学科和生命科学的前沿。本文对基因工程大鼠的研究进展作了总结。

2 转基因大鼠及其资源

转基因是建立大鼠疾病模型的主要方法，但在操作中该方法有以下不足:大鼠的超排卵受品系和个体影响较大，超排卵不易受精且胚胎易畸形，细胞质膜和核膜更厚更具有弹性，不易显微注射，卵胞质易损伤，注射后卵细胞易裂解，因此转基因大鼠的成功率低［17］。Rat Resource and Research Center收录了约40种转基因大鼠，包括 GFP、LacZ、Cre 等基因。

传统方式的转基因是将目的基因克隆至人工启动子下进行表达，不足是由于克隆载体承载外源基因能力有限，一些重要的调节元件如增强子、抑制子无法克隆至载体中。第二，由于人工启动子的局限性和插入位点的效应影响，目的基因可能无法精确地进行时空特异性表达。此外，由于使用的是cDNA，所以无法实现目的基因的可变剪切。人工细菌染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)介导的大鼠转基因克服了上述缺陷［18-21］。它是建立在E.coli F致育因子上的大片段DNA插入克隆［22］，可以承载大至400 kb的外源DNA，包括哺乳动物的基因以及启动子、增强子、抑制子、内含子，5’和3’非翻译区等。同时由于插入片段极大，消除了插入位点的影响，并且可以模拟体内的可变剪切，以及基因的时空特异性表达。

3 转座子技术介导的大鼠基因敲除

转座子是能够在基因组上跳跃或者复制后插入到新位点的基因片段。研究者研发了很多在哺乳动物细胞中具有活性的转座子和逆转座子系统，包括PiggyBac(PB)、Frog Prince、Sleeping Beauty(SB)等转座子和LINE1(L1)逆转座子［23-27］。SB经过不断优化，成为了啮齿类动物模型中转座子介导的基因操作的常用工具。SB转座子由鱼类的基因组中通过基因工程手段获得，包括两种组分。转座子两端为200～250 bp的反向重复序列(inverted repeats，IRs)，在IRs内部是转座酶结合位点正向重复序列 (direct repeats，DRs);中间是目的基因或者报告基因。转座酶由1600 bp的基因编码，属于Tc1/mariner转座子家族。SB转座子最初应用于大鼠的随机饱和突变，随后即可造成大鼠的插入突变［28］。该方法的流程是:首先分别获得表达转座酶和携有转座子序列的两种转基因大鼠，将两种大鼠杂交，获得双转大鼠。在该大鼠的生殖细胞中，转座酶通过剪切-粘贴的方式，将一个或多个转座子从原始插入位点切下并插入新位点。将双转大鼠和野生型大鼠再次杂交，获得只携有转座子的F1代转基因大鼠。由于转座酶的分离，体内的转座子即可固定。如果转座子系统和基因捕获系统结合，当转座子插入到基因的编码区时，插入到转座子中的基因捕获元件就破坏该基因的表达，造成基因敲除突变。基因捕获系统在转座子系统的帮助下，在基因组中跳跃，可对基因组进行饱和突变。有研究者采用了另一种方式，将转座子转化入精原干细胞中，首先通过抗性和报告基因在细胞水平筛选获得目的基因捕获克隆，进而获得具有目的表型的突变大鼠，从而提高转座子介导的基因 突 变 效 率［29］。PhysGen Program forGenomic Applications(http://pga.mcw.edu)利用转座子研制出91种转座子介导的基因敲除大鼠。如将转座酶克隆至组织特异性启动之下，转座酶在特定的组织表达，就会产生特定组织基因突变的大鼠。此外，在转基因操作中，如有转座酶的协助，单拷贝转基因的效率会显著提高［30］。

转座子介导的突变的优点如下:只需要将携有转座子序列和表达转座酶的大鼠杂交，操作简单。与基因打靶相比，转座子介导的基因捕获是随机的，但一般说来，单个F1个体中，只有少量的转座子插入，因此很容易的通过报告基因(例如eGFP，β-galactosidase或者tyrosinase)或者PCR来鉴定，并通过杂交来分离单插入位点。如在精原干细胞中进行该操作，可以在细胞中筛选。并且，利用精原干细胞进行转座子突变的效率很高。如果生殖细胞传代正常，将F1代杂合子杂交获得纯合的基因修饰动物只需要五个月。该方法的缺陷在于转座子在基因组中的插入并不是完全随机的，存在一定的“热点”和“冷点”。这就造成了基因捕获也不是完全随机的［31］。所以，在某些染色体区域，突变的范围和频率具有一定的局限性。

4 锌指酶介导的大鼠基因敲除

锌指酶是人工设计的含有两个功能结构域的蛋白核酸内切酶Fok I结构域和由重复的锌指结构组成的DNA识别结构域。每一个锌指结构可以特异地识别3个核酸，6个锌指结构就可以特异地识别18个核酸，从而决定了识别位点的特异性。核酸内切酶Fok I必须形成二聚体才能够将DNA双链剪开，因此要在目的位点左右两端都设计锌指酶［32，33］。锌指酶将DNA双链剪开形成双链缺口，修复该缺口有两种方式:可能造成DNA缺失或者插入的易错非同源末端连接［34］，该方式容易形成移码突变，过早的形成终止密码子，从而造成基因敲除［35］。锌指酶基因敲除大鼠起始于2009年，将编码锌指酶的DNA质粒或者mRNA进行原核显微注射，表达的锌指酶就可以造成基因的突变。将该受精卵移植入假孕母鼠体内，就会有突变的子代大鼠产生［36］。到目前为止，多个研究组通过该方法研发出了基因敲除大鼠［37-41］。另外一种修复方式为保守的同源修复，在常规状态下，会将缺口恢复如初，如果人为的转入两端连有缺口两端同源臂的外源基因，那么就会将该外源基因插入到缺口中，形成基因敲入［42］。

锌指酶基因修饰具有以下优点:第一，定向和高效［42］。第二，通过同源修复，可以精确地进行包括点突变和基因敲入在内的基因修饰。第三，在所有测试的品系中都能高效工作［36，38］。局限性在于锌指酶识别的目标序列长度是一定的，所以某些基因包括一些小基因和同源性高的基因，不可以被敲除。可以形成诱导或条件性敲除的大片段基因无法通过锌指酶技术敲入针对靶位点高效锌指酶的设计仍具有一定挑战性。此外，锌指酶具有一定的潜在脱靶效应［43］，虽然在大鼠中还未发现。

5 TALENs介导的大鼠基因敲除

TALENs是由来自于植物病原菌黄单孢菌的类转录激活因子效应因子TALEs，和核酸内切酶Fok I的催化区域融合而成［44-53］。高度保守的33～35个氨基酸TALEs重复组件，决定了TALEs结合DNA的识别特异性。在 TALEs中，被称为 repeat variable di-residues(RVD)的12和13位相邻的两个氨基酸，决定了识别的位点。天冬酰胺和异亮氨酸识别A，天冬氨酸和组氨酸识别C，天冬酰胺和甘氨酸酸识别T，两个天冬酰胺识别 G［44，45］。TALENs性质与锌指酶相似，识别特异的DNA序列，将其剪切形成双链缺口，通过同源修复或者非同源末端连接修复该缺口，从而造成了基因插入或缺失［54-57］。TALENs作为一种新兴基因修饰技术应 用 于 酵 母［50］，斑 马 鱼［58，59］，人 体 细 胞，癌 细胞［48，56，60，61］，干细胞［62］，基因敲除大鼠［63］。

TALENs和 ZFN相比，优点有二个方面:一是TALENs的识别位点更广泛，几乎可以敲除所有的基因;第二是TALENs的剪切效率比ZFN高，在Tesson的研究中，使用TALENs阳性率为59%，而相应的使用锌指酶方法的成功率为19%［63］。本试验室的对比研究中，也证实TALENs的剪切效率比ZFN高。

6 胚胎干细胞介导的基因打靶

2008年，有研究者分离出可用于基因打靶的胚胎干细胞，传代18代后40%的细胞仍保持正确核型。继续传代后细胞密度降低［64］。随后使用不同于小鼠干细胞培养基的纯化学成分，不含血清，添加GSK3、FGFRTK和MEK小分子抑制物的N2B27培养基，才建立并保持了具有生殖细胞分化能力的大鼠干细胞［10-12］。现在已从 Wistar、Sprague-Dawley(SD)、dark agouti(DA)、Longe Evans(LE)、Brown Norway(BN)和SHR 大鼠中分离出胚胎干细胞［10，11，14，65，66］。同小鼠技术路线一样，可以在大鼠干细胞水平进行基因打靶。DA、SD、Wisar大鼠胚胎干细胞的生殖细胞分化率极低［14］。至今只有DA大鼠的干细胞经过显微注射后移植入F344大鼠可以传代，而以SD大鼠为受体则无法成功［13，14，66］。

该方法的优点为定向打靶，条件敲除。缺点是受品系影响较大，可以参与生殖细胞发育的胚胎干细胞资源受限，细胞特性、培养条件有待稳定;嵌合体中供体和受体的细胞不易鉴定区分;另外该方法的生殖细胞分化效率远远低于小鼠［66］，所需时间长于TALENs和ZFN技术。

7 总结

由于大鼠在生理、某些行为、代谢等方面具有比小鼠更优良的特点，成为生命科学和医药研究期待的动物模型。基因工程大鼠的研究成为实验动物科学的热点。目前适用于大鼠基因工程的技术各有优缺点。TALENs和ZFN技术，目前只能实现系统敲除，而不易实现条件敲除，这对致死基因和特定组织的研究不利，有待于技术的进一步发展。大鼠胚胎干细胞基因打靶技术可以进行精确的条件性基因敲除，但是，大鼠胚胎干细胞的稳定性尚有待提高。转座子技术的应用，有可能发展为大规模条件敲除的优势技术，总之，大鼠基因修饰模型已经具有可行性，可以预见在不久的将来，大鼠将在人类疾病和生理研究中发挥重要的作用。

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