配伍对清热合剂中黄芩苷含量影响的研究

袁 汀，康美男

清热合剂由黄芩、大青叶、贯众、葛根、茵陈5味中药制成，具有清热解毒的功效，临床用于治疗病毒性上呼吸道感染引起的流感、腮腺炎等疾病的治疗［1-2］。清热合剂方中，黄芩为君药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。葛根为方中臣药，具有解表退热、生津止渴、止泻的功能，并能改善高血压患者的颈强、头晕、头痛、耳鸣等症状。大青叶具有清热、解毒、凉血、止血之功效，治疗温病热盛烦渴、流行性感冒、急性传染性肝炎、菌痢、痈疽肿毒等症;贯众杀蛔虫、绦虫、蛲虫，清热、解毒、凉血、止血，治疗风热感冒;茵陈清热利湿、退黄，主治黄疸、小便不利、湿疮瘙痒、传染性黄疸型肝炎等症。三药共为佐药，佐助黄芩、葛根共奏清热除瘟之功。黄芩中含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等多种黄酮类化合物，现代药理研究已经证明，黄芩苷具有抗病毒［3-4］、抗炎［5］、抑菌［6-9］等功效，为清热合剂中主要药效成分，黄芩苷含量高低直接影响清热合剂对其适应病症的治疗效果。近年来对中药复方制剂中黄芩苷含量受配伍影响的相关研究较多，实验结果已经证明，不同配伍能使多种复方中黄芩苷含量发生变化［10-13］。为明确清热合剂中各组方药材间配伍规律，有效控制该制剂质量，本文选取黄芩苷作为考察指标，依据正交试验设计原则，对比研究清热合剂7种不同配伍组成中黄芩苷的含量变化，以评价清热合剂中不同配伍组成对制剂中有效化学成分含量的影响。

1 材料

1.1 仪器 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AS3210型超声波清洗器(沈阳天美);E-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);TG328A电光分析天平(上海天平仪器厂);自动双重纯水蒸馏器(型号SZ-93，上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，110715-201016);中药材为市售并经我院副主任中药师鉴定;清热合剂(我院自制，批号:20120315、20120316、20120317);甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 采用Aglilent-Zorbax-Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温30℃;流动相为0.4%磷酸 －甲醇(55∶45);流速 1.0 mL/min;检测波长 280 nm;进样量20 μL。在上述色谱条件下，按黄芩苷计算，理论塔板数均不低于3 000，与相邻峰之间分离度均大于1.5，结果见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品25 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1 mg/mL的对照品储备液。精密量取储备液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度并摇匀，制成0.1 mg/mL的对照品溶液。

图1 黄芩苷对照品(A)、清热合剂样品(B)、清热合剂阴性样品(C)的HPLC色谱图注:1.黄芩苷

2.2.2 供试品溶液的制备 按照清热合剂制备工艺将处方组成中的黄芩、大青叶、贯众、葛根、茵陈5味药材以适宜方法进行提取，合并提取液，除去其中杂质，浓缩至所需比重范围内，即得清热合剂样品。精密量取清热合剂样品1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇约40 mL超声处理20 min，放冷，定容，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 除去黄芩以外的其他组方药材，按工艺制成清热合剂阴性样品，按照“2.2.2”中供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液，经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取“2.2.1”项下的黄芩苷对照品储备液 0.5、1、2、4、8 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20 μL，以黄芩苷进样量为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为y=72 348x-1 727.6(r=0.999 7)，黄芩苷在0.001～0.016 mg的范围内含量与峰面积呈良好线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样6次，测得黄芩苷的峰面积的RSD为0.93%，结果表明方法精密度良好。

2.5 重现性试验 精密量取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法平行制备成供试品溶液，分别进样20 μL进行测定，计算黄芩苷含量，其RSD为0.82%，结果表明方法重现性良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别在 0、1、2、3、4 h进样 20 μL，测定黄芩苷的含量，RSD为0.8%，结果表明供试品溶液在4 h内稳定性良好。

2.7 回收率试验 精密量取黄芩苷含量为0.065 93 mg/mL的清热合剂1 mL，分别精密加入黄芩苷对照品液0.7 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率，结果黄芩苷的平均回收率为99.2%，RSD为0.9%(n=6)，见表1。

表1 回收率试验结果(n=6)

3 正交试验考察不同配伍条件对黄芩苷含量的影响

3.1 正交设计 固定黄芩，以大青叶、贯众、葛根、茵陈为考察因素，各因素设“有”、“无”两水平，并考虑两两交互作用，因素水平表见表2。

3.2 供试品溶液的制备 按清热合剂制备工艺制备不同配伍组成的样品，按“2.2.2”项下方法制成对应样品溶液。

3.3 样品含量测定 按上述色谱条件进样测定各配伍组成样品的黄芩苷含量，结果见表3、表4。由实验数据可知，各因素对清热合剂中黄芩苷含量的影响差异无统计学意义。直观分析各因素对检测指标的影响大小顺序为茵陈＞葛根＞贯众＞大青叶。

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验结果

表4 方差分析表

4 讨论

正交试验是多因素多水平研究的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。正交试验设计是分式析因设计的主要方法，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。为了加强对清热合剂的处方循证研究，根据文献建立了黄芩苷含量的HPLC测定方法［11］，选择方剂中主药黄芩中黄芩苷为不变量，其他为因变量，研究有效成分黄芩苷在不同配伍组成条件下的变化。

本实验采用L8(27)正交设计法及正交助手软件对清热合剂中的黄芩苷含量进行分析，结果显示，大青叶与贯众对黄芩苷的含量影响不大，茵陈与葛根的加入则明显降低了黄芩苷的含量;大青叶与茵陈，贯众与葛根，贯众与茵陈的交互效应使黄芩苷的含量降低;大青叶与葛根、葛根与茵陈、大青叶与贯众的交互效应对黄芩苷含量影响不明显。

从实验结果可见，中药的配伍不是药物之间的简单加合，中药的不同配伍组成对处方中有效成分的含量是有一定影响的。在中药制剂过程中必然会发生一系列物理、化学反应，一部分可能是单纯的化学成分含量增减变化，同时在一定的溶剂中，在温度影响以及某些物质的催化作用之下，也可能生成新的化学物质。因此，考察制剂配伍规律，除考察特定化学成分的含量变化之外，还应结合制剂的整体成分变化及药效作用进行全面分析，这项研究还有待于今后进一步开展。

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