对羟基联苯比色法测定乳酸显色反应条件的研究

万楚筠，钮琰星，黄凤洪，* ，胡双喜

(1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062;2.油料脂质化学与营养湖北省重点实验室，湖北武汉430062)

乳酸(Lactic acid，分子式C3H6O3)，作为一种含有羟基和羧基的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中［1］，是三大有机酸之一。乳酸即是生物体无氧糖代谢的重要产物，也是一种重要的食品添加剂，在食品、医药、化学工业、皮革、香料等领域用途广泛［2］，因而成为国内外研究者重点研究的对象。为此，建立一套稳定、准确和成本较低的乳酸定量测试方法成为顺利开展乳酸研究的关键。现在已经建立起来的乳酸测定方法主要有:容量法［3-4］，分光光度法［5-6］和色谱分离法［7-8］。容量法对乳酸测试的特异性低，易受干扰，准确度不高，但操作简单，设备要求低;紫外分光-酶法虽然快速准确，但需要用到的乳酸脱氢酶价格较贵，不易获得，实验操作要求及费用较高;可见光比色法采用对羟基联苯显色，对于乳酸检测特异性较好、灵敏度高，不需要特殊试剂，准确性较高、测试成本低，但操作略显繁琐。色谱法精确度较高，但设备昂贵，需要对测试样品进行严格的前处理，对操作人员要求较高;因此，在缺少一些较昂贵的设备时，采用对羟基联苯比色法测乳酸成为广大食品企业的经济之选。目前有关对羟基联苯比色法测乳酸的文献报道中［5，9-12］，研究者所述的显色条件、步骤和现象等都存在较大差异，对于显色后溶液的最大吸收波长、沸水浴时间、显色剂浓度和用量均有不同说法，迄今为止还未见对该方法的显色条件进行系统研究的相关报道。本实验在综合前人研究的基础上，对比色法测乳酸的显色条件进行系统的分析和探讨，以期为食品中乳酸的测定研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水乳酸锂、对羟基联苯、五水硫酸铜、浓硫酸(95%～98%，密度为1.84g/cm3)、氢氧化钙 均为分析纯;4%硫酸铜溶液(w/v)称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)4g，加蒸馏水约70mL，加热使溶解，再用蒸馏水稀释至100mL;称取对羟基联苯1.5g溶于0.125mol/L氢氧化钠100mL中(稍稍加温助溶，最好不要超过80℃)，贮于棕色瓶试剂中，保存于4℃冰箱内，可使用一个月;乳酸标准储存液(1mg/mL)精确称取无水乳酸锂106.5mg，溶于50mL蒸馏水中，加0.5mol/L硫酸20mL，再加蒸馏水稀释至100mL，混匀后保存于4℃冰箱;乳酸标准应用液(200μg/mL)使用时取储存液5mL用蒸馏水稀释至25mL，在4℃冰箱中，可保存数天。

紫外可见光分光光度计、恒温水浴锅、电子分析天平、电炉。

1.2 实验方法

吸取待测样液0.5mL在各比色管中，再加入少许4%硫酸铜溶液，混匀后将预冷的浓硫酸缓慢加入各管中，摇匀后置于沸水浴中加热5min，取出后迅速置于冰水浴中冷却至20℃以下。然后在各管中缓慢加入1mL蒸馏水和1.5%对羟基联苯溶液少许，充分振摇后，水浴保温一段时间进行显色反应。显色完成后，再将各管置于沸水浴中加热90s后，立即放入冰水浴中冷却至室温后测其最大吸光值。

1.2.1 浓硫酸加入量的影响 吸取标准应用液2.5mL加入蒸馏水7.5mL配成乳酸浓度为50μg/mL的待测液。按方法1.2所述的步骤进行操作，操作条件分别是:4%硫酸铜溶液0.05mL，加入各管的硫酸量分别为 4、5、6、7、8mL，沸水浴时间为 5min，1.5%对羟基联苯溶液为0.05mL，显色水浴温度为30℃时间为15min，显色后沸水浴加热时间为90s，操作完成后，用分光光度计扫描各管的最大吸收波长和吸光值。

1.2.2 加入显色剂后保温静置时间和温度的影响其它条件如1.2.1所示，加入各管的硫酸量为6mL，显色水浴温度为30、40、50、60℃时，保温时间分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40min。

1.2.3 对羟基联苯添加量的影响 其它条件如1.2.2所示，1.5%对羟基联苯溶液为 0.02、0.05、0.08、0.11、0.14mL，改变补加水量使显色剂与蒸馏水的总体积仍为 1.05mL，显色水浴温度为 50℃，保温时间为15min。

1.2.4 加入显色剂后沸水浴时间的影响 其它条件如1.2.3所示，1.5%对羟基联苯溶液为0.05mL，显色后沸水浴时间分别为 75、90、105、120、135s。

1.2.5 乳酸与浓硫酸共热时间的影响 其它条件如1.2.4所示，加入浓硫酸后沸水浴时间分别为3、4、5、6、7min，显色后沸水浴时间为90s。

1.2.6 显色物质的稳定性 按上述条件显色后的溶液，在其最大吸收波长下测其在室温下放置0、30、60、90、120、150min 时的吸光值。

1.2.7 标准曲线的制作 配制不同乳酸浓度的标准测试液后，吸取标准测试液0.5mL按上述步骤显色，测其吸光值，并绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 浓硫酸加入量的影响

浓硫酸加入量对显色反应的影响如图1所示，从图中可以看出随着浓硫酸添加量的增加，显色液的最大吸光值也随之增大，同时最大吸收波长也逐渐变小，从578nm变动到567nm。这说明浓硫酸的相对浓度对显色反应具有显著的影响。

图1 不同浓硫酸加入量时显色后溶液最大吸收波长扫描Fig.1 The maximum absorption wavelength scanning of chromogenic solution obtained by using different concentrations sulfuric acid

根据比色法测乳酸的原理可知，浓硫酸在测试过程主要有以下几种作用:一是在加热条件下将乳酸分解为乙醛和甲酸，而甲酸不稳定在浓硫酸的作用下发生脱水反应生成一氧化碳和水;二是乙醛和对羟基联苯反应，在浓硫酸的作用下可能在对羟基联苯OH基团的邻位上发生缩合，而形成二对羟基联苯基乙烷;在浓硫酸溶液中二对羟基联苯基乙烷会缓缓地氧化成未知结构的紫色产物。在整个反应体系中浓硫酸主要起缩合剂和氧化剂的作用。在显色过程中，也观察到，反应溶液的颜色先是由无色变为蓝色，然后在静置的过程中渐渐变紫，浓硫酸加入量不同最后变紫的程度也不同。由此可以推断，当浓硫酸的相对浓度变化时，其缩合和氧化能力随之改变，导致反应生成发色体的质和量也有所改变，从而引起吸光值和最大吸收波长的变动。

2.2 加入显色剂后保温静置时间和温度的影响

显色反应完成需要一定的温度和时间，由图2可知，当水浴温度为30℃时，随着保温时间的增加，反应溶液的吸光值也迅速增加，但是保温时间超过30min时，溶液吸光值几乎保持不变，其最大吸光值为1.1652;当水浴温度为40℃时，溶液吸光值的变化趋势与30℃时类似，只是在保温时间为25min时，溶液吸光值就不再变化，最大吸光值比30℃时降低了7.94%;当水浴温度为50℃时，保温时间达到10min时，溶液吸光值就趋于稳定，随着保温时间的增长，吸光值增加非常缓慢，最大吸光值只有30℃时的72.5%，降低明显;水浴温度达到60℃时，保温时间在5～40min变化时，溶液吸光值比较稳定，总体呈缓慢减小的趋势。

图2 保温静置时间和温度对显色反应的影响Fig.2 Effect of water bath time and temperature on the chromogenic reaction

有研究表明［13］，对羟基联苯在35℃以上时，易被浓硫酸氧化破坏，从而引起颜色损失。从图2可以明显看出，在水浴温度为50℃时，加热10min对羟基联苯就基本被破坏，从而使吸光值不再变化;当水浴温度达到60℃，对羟基联苯被迅速氧化，使反应溶液吸光值显著降低。

2.3 对羟基联苯添加量的影响

对羟基联苯添加量对显色反应的影响见图3所示。从图3可以看出，显色后溶液吸光值随着对羟基联苯添加量的增加而升高，当添加1.5%的对羟基联苯溶液达到0.11mL时，溶液吸光值达到最大，之后再增加对羟基联苯的量，溶液吸光值无明显变化。

图3 对羟基联苯添加量对显色反应的影响Fig.3 Effect of p-hydroxydiphenyl dosage on the chromogenic reaction

2.4 加入显色剂后沸水浴时间的影响

在加入显色剂后，由于对羟基联苯不溶于强酸，在溶液中呈白色絮状悬浮，随着显色反应的进行，悬浮物逐渐减少，反应溶液的颜色也由无色变为蓝色，当显色过程结束后溶液略显紫色，将反应溶液置于沸水中加热超过1min时，溶液的颜色变得更紫，也更澄清透明。由图4可以看出，反应溶液吸光值随着沸水浴时间的增加略有降低，在沸水浴90s之后吸光值趋于稳定。

对显色溶液沸水浴一定时间，目的是通过破坏显色剂使溶液变得更澄清，并且使溶液的颜色变得更稳定。也有研究表明［13］:显色后沸水浴时间在1～2min之间变动时，对结果没有影响，但长时间的加热会影响颜色的光谱属性。

图4 显色后沸水浴时间对显色反应的影响Fig.4 Effect of the boiling water bath time on the chromogenic reaction

2.5 乳酸与浓硫酸共热时间的影响

浓硫酸可将乳酸氧化分解为乙醛，这个反应需要在加热的条件下才能发生。由图5可知，浓硫酸与乳酸在加热4min后就可将乳酸完全转化为乙醛，溶液吸光值达到最大，之后继续加热溶液吸光值变化不大。实际操作过程中为了确保乳酸与浓硫酸能充分反应，适当延长沸水浴时间是必要的，因此在进行样品测定时取沸水浴时间5min较为合适。

图5 浓硫酸与乳酸共热时间对显色反应的影响Fig.5 Effect of the time to heat the concentrated sulfuric acid and lactic acid on the chromogenic reaction

2.6 显色物质的稳定性

乳酸与浓硫酸在加热条件下生成的乙醛与对羟基联苯反应，在对羟基联苯OH基团的邻位上发生缩合，而形成二对羟基联苯基乙烷在浓硫酸溶液中二对羟基联苯基乙烷会缓缓地氧化成未知结构的紫色产物。从图6可以看出，当加热完成后，该紫色产物的颜色非常稳定，其在570nm处有最大吸收峰，初始吸光值为0.8254，在室温放置150min后，其吸光值为0.8284，变化非常小。

2.7 标准曲线的制作

根据上述研究，选择加入待测样品量0.5mL，4%硫酸铜溶液加入量0.05mL，浓硫酸加入量6mL，浓硫酸与乳酸沸水浴时间5min，1.5%对羟基联苯添加量0.11mL，在30℃下水浴显色30min后再沸水浴90s为反应条件，测定标准测试液乳酸浓度在0～50μg/mL之间变化时的吸光值，绘制曲线如图7所示。

从图7可以看出，在上述反应条件下，乳酸浓度在0～15μg/mL范围内与吸光值基本呈线性关系(R2=0.997)，当乳酸浓度大于20μg/mL溶液吸光值与线性偏差逐渐变大。

图6 显色完成后溶液放置时间对吸光值的影响Fig.6 Effect of the standing time after chromogenic reaction completion on absorbance values

图7 乳酸浓度与吸光值之间的关系Fig.7 The relationship between lactic acid concentration and absorbance values

3 结论

对采用对羟基联苯为显色剂测定乳酸的反应条件进行了系统研究。结果表明浓硫酸对显色反应有重要影响，当浓硫酸的相对浓度发生变化时，显色体系的最大吸收波长和吸光值也相应改变，因此在浓硫酸添加量或是样品量相对值发生变化时要重新扫描反应体系的最大吸收波长，以获得最佳灵敏度。显色水浴保温时间和温度对测定方法的灵敏度也有较大影响，在其它条件不变的情况下，水浴温度为30℃时，保温30min可以获得最大吸光值;当显色水浴温度达到60℃，对羟基联苯被迅速氧化，使反应溶液吸光值显著降低，因此在显色过程中要严格控制显色反应体系的温度。选择加入待测样品量0.5mL，4%硫酸铜溶液加入量0.05mL，浓硫酸加入量6mL，浓硫酸与乳酸沸水浴时间5min，1.5%对羟基联苯添加量0.11mL，在30℃下水浴显色30min后再沸水浴90s为反应条件进行显色，结果表明乳酸浓度在0～15μg/mL范围内与吸光值基本呈线性关系(R2=0.997)。

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