洪泽湖野生河蚬抗氧化肽酶解工艺及清除自由基能力的研究

刘晶晶，顾 云，黄 婷，韩曜平，王雪锋，戴阳军，苏 慧

(1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500;2.高淳县质量计量检测所，江苏南京211300)

目前国内使用的抗氧化剂大多由化学合成，而一直以来，人们对化学合成抗氧化剂的安全性早有质疑。世界卫生组织、欧共体儿童保护组织、英国生物工业协会、日本和美国政府及组织的研究表明，合成抗氧化剂有很多副作用，例如对人体的肝、脾、肺有不利影响，可诱发恶性肿瘤等。在人们长期食用的食品中，天然抗氧化剂成分的毒性远远低于人工化学合成的抗氧化剂毒性。因此，作为最活跃的研究课题之一，从自然界中寻求天然抗氧化剂的研究已引起科研学者的高度重视，研究和开发天然抗氧剂的兴趣也呈指数式增长。特别是利用生物酶技术水解鱼类、贝类，酶解液表现强抗氧化活性［1-2］。河蚬是双壳类软体动物，经济价值高，肉味鲜美，营养丰富，而且具有较好的药用效果。河蚬含七种人体必需氨基酸，其中两种为人体半必需氨基酸，蛋白质含量高于牡蛎［3］、文蛤［4］、翡翠贻贝［5］、美洲帘蛤［6］。河蚬软体部分中必需氨基酸组成相对均衡，接近FAO/WHO(1973)提出的人体必需氨基酸均衡模式。河蚬体内富含 K、Na、Ca、Mg、Fe等常量元素和 Zn、Cu、Mn等微量元素，显示它具有很高的营养保健价值，即值得进一步开发生产［7］。作为中药药材，河蚬具有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰、解酒等功效［8］。洪泽湖野生河蚬更因其品质优良、味道鲜美、营养丰富、个体大等特点在国内外市场享有很高的声誉。本实验以洪泽湖野生河蚬为原料，探讨抗氧化肽的酶解工艺条件及其清除自由基能力，为河蚬的深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

洪泽湖野生河蚬 江苏省宿迁楠景水产品有限公司;木瓜蛋白酶 酶活力大于6000U/mg，购于国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白酶 酶活力1000～1500U/mg，购于上海蓝季科技发展有限公司;维生素C、BHT、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、邻苯三酚、DPPH标准品、无水乙醇、邻二氮菲、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、双氧水、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁等试剂 均为分析纯。

Anke LXJ-ⅡB离心沉淀机 上海安亭科学仪器厂;722s可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;722紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;FA 2004电子精密天平 上海仪器天平厂。

1.2 实验方法

1.2.1 河蚬肉的预处理 将河蚬肉流水解冻，在低温条件下，按1∶3的料液比加水后用组织捣碎机匀浆，即为河蚬浆液。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同复配比例蛋白酶酶解液的清除羟自由基能力 取一定量的河蚬浆液，调节pH为6，分别加入蚬肉质量0.5%的不同复合比的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶(0∶5、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0)，50℃下酶解 3h，100℃灭酶20min、离心后得到不同比例蛋白酶的酶解液，分别测定其·OH清除率。

1.2.2.2 初始pH的确定 取一定量的河蚬浆液，调节其 pH 分别为 3、4、5、6、7，加入 0.5% 胰蛋白酶，50℃下酶解4h，100℃灭酶20min、离心后得到不同初始pH的酶解液，分别测定其·OH清除率。

1.2.2.3 酶解时间的确定 取一定量的河蚬浆液，调节其pH为4，加入0.5%胰蛋白酶，在50℃下分别酶解 1、2、3、4、5h，100℃灭酶 20min、离心后得到不同酶解时间的酶解液，分别测定其·OH清除率。

1.2.2.4 酶解温度的确定 取一定量的河蚬浆液，调节其pH为4，加入0.5%胰蛋白酶，分别在30、40、50、60、70℃下酶解 4h，100℃灭酶 20min、离心后得到不同酶解时间的酶解液，分别测定其·OH清除率。

1.2.3 清除自由基能力的测定 清除羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由(·)和二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)能力的测定，按参考文献［9-11］方法测定。

1.2.4 还原能力的测定 采用普鲁士蓝反应法［12］比较河蚬酶解液、VC、BHT的还原能力。向0.4mL样品中加入0.2mol/L、pH6.6的磷酸缓冲溶液2mL，10g/L的铁氰化钾［K3Fe(CN)6］溶液2mL，混匀，在50℃下保温20min;加入10%三氯乙酸溶液2mL，振荡混匀后在4000r/min下离心10min;取上清液2mL，加2mL蒸馏水和0.4mL 1g/L的FeCl3溶液，静置10min后体系溶液由黄色变为蓝色，在700nm下进行比色;分别记录其吸光值，平行测定3次。

1.3 数据统计分析

所有实验至少3次重复，采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同复配比例蛋白酶酶解液的清除羟自由基能力

由图1可知，在相同反应条件下，单一胰蛋白酶酶解液的清除羟自由基效果优于复合蛋白酶，复合蛋白酶中胰蛋白酶的比例越大，清除效果越强，单一木瓜蛋白酶酶解液的清除羟自由基能力最弱。推测原因可能是，各种蛋白酶水解反应条件和产物多肽的N-末端、C-末端氨基酸组成和序列不同，木瓜蛋白酶与胰蛋白酶也不能产生协同作用，影响了活性物质清除羟自由基的能力。基于该项数据，本实验采用胰蛋白酶来探讨河蚬抗氧化活性肽的酶解工艺条件。

图1 不同复合比(木瓜蛋白酶:胰蛋白酶)酶解液的羟自由基清除率Fig.1 Effect of hydrolysates produced by different compound ratio(Papain:Trypsin)on scavenging rate of hydroxyl radical

2.2 最佳酶解条件(以·OH清除率计)的确定

2.2.1 初始pH的确定 从图2可以看出，反应体系的pH对酶解液清除·OH的能力有较大影响，酶解液的·OH清除率随初始pH的增加而先增后降，在pH4时达到最大值。蛋白酶的本质是蛋白质，其催化反应的能力受反应环境pH影响，具体表现为pH会影响蛋白质的空间构象，另外pH也会影响酶分子及底物、酶-底物复合物的解离。偏离最适pH时酶的活性逐渐降低，因此体系过酸或过碱均不利于酶促反应，数据表明，该反应的最适pH为4，此时酶解液清除·OH能力最高。

图2 初始pH对·OH清除率的影响Fig.2 Effect of initial pH on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.2.2 酶解时间的确定 由图3可以看出，酶解液的·OH清除率随着酶解时间的增加而先增后降，在酶解4h时达到最大值。这是由于酶解初期，酶量充足，底物可断裂的肽键较多，酶解液中抗氧化肽含量上升较快。酶解一定时间后，酶解液中抗氧化肽的含量增加缓慢，且随着水解时间的延长，抗氧化肽含量增加不明显且随着时间的延长抗氧化肽活性下降。

图3 酶解时间对·OH清除率的影响Fig.3 Effect of time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.2.3 酶解温度的确定 由图4可知，在初始pH、酶解时间相同，酶解温度不同的反应条件下，酶解液清除·OH能力的变化情况，其中50℃时酶解液的·OH清除率最高。因为蛋白酶有其自身最适宜反应温度，在最适温度时，酶活力最强，酶解效果最好，酶解液清除·OH的能力最强。低于或高于最适温度时，酶活力下降，酶解液清除·OH的能力也随之下降。

图4 酶解温度对·OH清除率的影响Fig.4 Effect of temperature on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.2.4 L9(34)正交实验 根据单因素实验结果，添加0.5%的胰蛋白酶，选用初始pH、酶解温度、酶解时间为实验因素，以·OH清除率为评判指标，进行L9(34)正交实验。正交实验因素水平及结果见表1。

从表1的极差分析结果可知，影响·OH清除率的各因素的主次关系为:A(初始pH)＞C(酶解时间)＞B(酶解温度)，酶解的最佳工艺(以·OH清除率计)为:初始pH为3.5，酶解时间为3.5h，酶解温度为45℃。

2.2.5 验证实验 在酶解最优条件下，即初始pH为3.5，酶解时间为3.5h，酶解温度为45℃的条件下，所得酶解液·OH清除率为76.19%。

2.3 与VC、BHT在不同体外抗氧化模型下的比较结果

2.3.1 清除羟离子自由基能力比较 从图5看出，河蚬酶解液、VC和BHT均有较好的清除羟自由基能力，三者的清除率分别为74.82%、89.48%、91.65%，其中相同浓度的VC和BHT清除羟自由基能力之间没有显著性差异。而相同浓度的河蚬酶解液的羟自由基清除能力和VC与BHT之间差异较显著。

表1 ·OH清除率的正交实验设计及结果Table 1 Orthogonal array design and results of the scavenging rate of hydroxyl radicals

图5 酶解液、VC及BHT对羟自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of enzymatic hydrolysate，VCand BHT on hydroxyl radical

2.3.2 清除超氧阴离子自由基能力比较 如图6所示，河蚬酶解液对超氧阴离子的清除率为24.61%，而VC对超氧阴离子有较好的清除作用，达到56.7%;其中河蚬酶解液对超氧阴离子的清除作用与VC之间呈显著性差异，和BHT之间呈非显著性差异。

2.3.3 还原能力比较 如图7所示，河蚬酶解液的还原能力与VC相近，A700nm分别为0.381和0.404，且与VC之间呈非显著性差异;而BHT的还原能力相对较弱，其 A700nm为0.316，与河蚬酶解液之间呈显著性差异。

2.3.4 清除二苯代苦味肼基自由基能力比较 如图8所示，VC有很强的清除二苯代苦味肼基自由基能力，BHT次之，河蚬酶解液清除DPPH·的能力最弱，其清除率仅为24.04%;且三者之间均呈显著性差异。

图6 酶解液、VC及BHT对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of enzymatic hydrolysate，VCand BHT on superoxide radical

图7 酶解液、VC及BHT的还原能力Fig.7 Reducing power of enzymatic hydrolysate，VCand BHT

图8 酶解液、VC及BHT对DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of enzymatic hydrolysate，VCand BHT on DPPH radical

3 结论

3.1 在相同反应条件下，单一胰蛋白酶酶解液的清除羟自由基效果优于复合蛋白酶;复合蛋白酶中胰蛋白酶的比例越大，清除效果越强;单一木瓜蛋白酶酶解液的清除羟自由基能力最弱。

3.2 经过L9(34)正交实验分析，酶解的最佳工艺(以·OH清除率计)为:初始pH为3.5，酶解时间为3.5h，酶解温度为45℃，所得酶解液·OH清除率为76.19%。

3.3 清除自由基能力的实验结果表明，河蚬酶解液对超氧阴离子的清除率高于BHT，对羟自由基、二苯代苦味肼基自由基的清除率均低于BHT，此外，河蚬酶解液的还原能力与同浓度的VC接近，高于同浓度BHT的还原能力。综合考虑到BHT作为化学合成抗氧化剂有使用限量(200μg/mL)，且实验并未将酶解液抗氧化肽分离纯化，所以河蚬酶解液的清除自由基能力与BHT相近。

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