PCR—DGGE法分析婴儿肠道菌群多样性

费 鹏 白洪健 程述震 曹飞扬

FEI Peng BAIHong-jian CHENG Shu-zhen CAO Fei-yang

郭 鸰 姜亦超 苑秀娟 江 岩

GUO Ling JIA Yi-chao YUAN Xiu-juan JIANG Yan

（东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education Food Science College,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

传统研究肠道菌群的方法存在极大的局限性，纯培养只能研究比较容易培养的微生物。据估计，目前肠道中能培养的细菌仅占肠道内总细菌数的10%～50%[1]，所以依赖传统培养技术不能完整准确地反映微生物群落的组成情况与变化情况。16S rDNA普遍存在于在细菌中，其交错排列的可变区和保守区可应用于研究细菌的种系发生学关系，在细菌鉴别和分类方面，基于16S rDNA的序列分析方法被称为“金标准”[2,3]。基于16S rDNA的变性梯度凝胶电泳(denatured gra dient gel electrophoresis，DGGE)指纹图谱技术，可以检测到DNA片段中的单碱基变化，被广泛应用于细菌群落结构的研究中，同时在揭示自然界微生物群落种群差异和遗传多样性方面也具有独特的优越性[4]。

食源性疾病是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质（包括生物性病原体）等致病因子所造成的疾病，扰乱肠道粘膜细胞的吸收，进而影响了肠道微生态平衡[5]。由于婴儿免疫力低，更容易患食源性腹泻。怎么通过改善婴儿的饮食从而降低该类疾病的发生成为难题。近年来有文献[6]报道某些益生菌可以有效的缩短一些食源性疾病的病程，减轻病症，但这些报道只是针对某种益生菌的作用进行研究，并没有针对婴儿肠道菌群的特点进行系统的分析，具有一定的局限性。本试验通过PCR-DGGE技术对婴儿肠道菌群进行多样性分析，将健康婴儿和食源性疾病婴儿的肠道菌群进行对比，有助于确定对食源性疾病有预防和治疗作用的益生菌的种类，为婴儿配方乳粉中益生菌种类的选择提供了有效的研究方法。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

QIAamp DNA StoolMini Kit：德国 Qiagen公司；

引物合成：北京天根生化科技有限公司；

Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×PCR buffer：大连 TaKaRa公司；

琼脂糖：美国Sigma公司；

溴化乙锭(EB)：美国Sigma公司；

无水乙醇：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；

尿素：分析纯，西陇化工股份有限公司；

丙烯酰胺、去离子甲酰胺、四甲基二乙胺：分析纯，北京博奥拓达科技有限公司；

亚甲基双丙烯酰胺：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

过硫酸铵：天津市博迪化工有限公司；

PCR仪：Gene Amp PCR system 9700，美国 ABI公司；

电泳仪：The DCodeTM Universal Mutation Detection System，美国Bio-Rad公司；

UVP凝胶成像系统：GelDoc-It image system，美国 Bio-Rad公司。

1.2 研究个体情况

(1)健康婴儿组：15例健康母亲顺产的足月健康儿，均为0～1岁，无腹泻或其他胃肠道病史，正常喂养。上述对象采样前4周内均未服用过微生态制剂(包括酸奶)及抗生素。

(2)食源性腹泻婴儿组：15例食源性疾病婴儿，均为健康母亲顺产足月儿，均为0～1岁，经哈尔滨市儿童医院确诊为食源性疾病引起腹泻。

上述对象采样前4周内均未服用过微生态制剂(包括酸奶)及抗生素。

1.3 粪便样品采集

对所有个体采集新鲜粪便样品。新鲜粪便采集后立即装入厌氧盒中(GENbox anaer，Biomérieux)，置于冰上，立即送入实验室-80℃保藏。

1.4 粪便样品总DNA的提取

参照QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒说明提取样品总DNA，为了提高粪便样品中细菌细胞的裂解效率，在加入ASL(粪便裂解液)以后的水浴温度提高为95℃。

1.5 细菌16S rDNA V3区PCR

细菌通用引物 16S rDNA V3 区：BA338f（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 引物 5′端加一个 40 bp“G C”夹(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)和 UN518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTCC-3′)[7]，引物由北京天根生化科技有限公司合成。50μL PCR反应体系：5μL总DNA作为模板，1 U Taq DNA聚合酶，0.2 mM dNTP，1μM的上下引物，10mM 10×PCR buffer(含 15 mmol/LMgCl2)，去离子无菌水补充体系至50μL。PCR反应条件：92℃预变性2min，然后进行30个循环，每个循环包括变性 92℃1min，复性55℃ 30 s，延伸72℃ 1min。最后72℃ 延伸6min[8]。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，UVP凝胶成像系统拍照记录结果。

1.6 细菌16S rDNA V3区变性梯度凝胶电泳（DGGE）

应用The DCodeTM Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)电泳系统。DGGE变性梯度凝胶浓度为8%，变性梯度为30%～55%(7mol/L尿素和40%甲酰胺为100%变性)。电泳条件为1×TAE电泳缓冲液，60℃，20 V，电泳10 min后，70 V，18 h[9]。电泳完成后置凝胶于GeneFinder染液中染色30min，UVP凝胶成像系统拍照记录结果。

1.7 DGGE图谱的多样性分析

使用Quantity One（Bio-Rad）软件对DGGE图谱进行聚类和相似性分析。

2 结果与分析

2.1 食源性腹泻婴儿和健康婴儿16S rDNA的DGGE图谱

将健康婴儿和食源性疾病婴儿的粪便样本16S rDNA PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，可以得到其样本的DGGE图谱，结果见图1。

图1 不同样本的肠道菌群多样性DGGE电泳图Figure 1 DGGE profiles of intestinalmicroflora diversity from the different samples

2.2 食源性腹泻婴儿和健康婴儿DGGE图谱的分析

约200 bp的PCR产物在凝胶上得到分离，在DGGE电泳图上，每一条带代表一个或者一类细菌。DGGE（图1）结果表明，使用16S rDNA V3区的引物得到的微生物多样性很丰富，总共呈现出31个不同位置的条带，并且不同婴儿粪便样本的DGGE带谱在条带的数量、位置及条带的亮度上均存在着不同程度上的差异。其中，食源性腹泻婴儿肠道菌群的多样性比健康婴儿肠道菌群的多样性低。此外，可以明显看出健康婴儿组和食源性腹泻婴儿组的最亮条带位置也有所不同，说明两组样本肠道菌群的优势菌不一样。

2.3 食源性腹泻婴儿和健康婴儿的聚类和相似性分析

使用 Quantity One（Bio-Rad）软件，采用 UPMAGA 的方法比较各个泳道之间的相似性树状树（图2），可以得出1～5、11～15、21～25 号样本可以聚为一类，6～10、16～20、26～30 号样本可以聚为一类。通过相似性分析（图3）可以得出食源性疾病样品之间的相似性较高，而健康婴儿样品之间有一定的相似性。但食源性疾病样品之间的相似性更高，且两者肠道菌群有明显的差异。

食源性腹泻样品之间的相似性较高，这是由于食源性腹泻引起腹泻，使得个体差异消除；而健康婴儿样品之间有一定的相似性，但不高，是由于健康婴儿受遗传、环境、喂养方式等的影响，产生的个体差异。而两类之间的差异也是食源性疾病引起腹泻所致。

3 讨论

自20世纪80年代初最先被提出DGGE技术，它是一种用于检测DNA突变的电泳技术[10]，可反映微生物群落中数量上大于1%的优势种群。因此，DGGE相比于传统微生物分析方法有着无可比拟的优势，在分子微生物学领域得到广泛的应用[11]。

图2 不同婴儿样本肠道菌群UPMAGA聚类分析图谱Figure 2 Cluster analysis of intestinalmicroflora from different infant samples by UPGMA

图3 不同婴儿样本肠道菌群相似性分析Figure 3 Similarity analysis of intestinalmicroflora from different infant samples

PCR—DGGE技术已经广泛应用于人体肠道多样性的研究当中，人们利用这种方法研究了不同人群肠道菌群的多样性，如糖尿病病人、肥胖人群，不同喂养方式和不同分娩方式婴儿等等。然而对食源性腹泻婴儿肠道菌群多样性的研究尚少。本试验利用PCR—DGGE等分子生物学技术对食源性腹泻婴儿和健康婴儿的粪便样本进行多样性研究，发现两类样本之间存在着明显的差异。食源性腹泻婴儿的肠道菌群多样性较健康婴儿的低，且两类的优势菌群也存在着不同。此外，食源性腹泻婴儿之间的肠道菌群相似性较高，两类婴儿之间的肠道菌群存在着明显的差异。可见利用PCR—DGGE技术可以很好的分析婴儿肠道菌群的多样性，这也为确定婴儿配方乳粉中益生菌种类应用提供了研究方法，然而，要确定益生菌的种类，还要对两类婴儿肠道菌群的具体差异进行进一步的研究和探索。

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7 Muyzer G,DeWaal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol.，1993,59(3):695～700.

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9 Maria Befring Hovda,Morten Sivertsvik,Bjφrn Tore Lunestad,et al.Characterisation of the dominant bacterial population inmodified atmosphere packaged farmed halibut (Hippoglossus hippoglossus)based on 16S rDNA-DGGE[J].Food Microbiology,2007,24(1～4):362～371.

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11 Ferguson A S,Huang W E,Lawson K A,et al.Microbial analysis of soil and groundwater from a gasworks site and comparison with a sequenced biological reactive barrier remediation process[J].J.Appl Microbiol.，2007,102(5):1 227～1 238.