人参果茎尖分生组织试管苗再生体系的建立与优化

张菲菲，张金文，石 菁

（甘肃农业大学农学院国家级植物生产类实验教学示范中心，甘肃 兰州 730070）

人参果（Solanum lycopersicum），又名茄瓜、香瓜茄、南美仙桃等，为茄科茄属多年生草本植物，是20世纪80年代后国内引进和推广种植的新型果蔬作物，果肉清香多汁、高蛋白、低糖、低脂肪且富含多种微量元素，特别是硒和钼的含量较高，也是糖尿病人的理想水果［1，2］。近年来，国内在节能日光温室栽培人参果的面积迅速扩大，部分地区已成规模化种植［3］。甘肃省人参果栽培主要分布在武威市凉州区、天祝县、古浪县，其中，凉州区的张义镇和天祝县的哈溪镇栽培相对集中，面积较大，已发展成为河西走廊的重要产业［4］。

伴随着产业化发展的逐年推进，人参果的栽培也陆续出现了一些问题。人参果在北方及西部多采用温室栽培，农户为降低生产成本，自主、无序的扦插繁殖，且无限期的延长栽培年限，导致品种混杂、种性严重退化，病毒病为害加重，品质、产量下降。有研究证明病毒是通过维管束传导的，利用维管束尚未分化的茎尖进行培养，再生植株结合高温脱毒处理后可以获得健康苗［5］。有关人参果脱毒及快繁研究已有报道［5－8］，但系统的将茎尖脱毒和植株再生体系相结合的报道较少。借鉴前人的技术，经过研究优化，建成了实用性良好的人参果脱毒及再生体系，为人参果脱毒种苗生产及下一步通过基因工程技术获得抗病毒品系及优良种质资源奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人参果组织培养材料由甘肃农业大学农学院遗传育种实验室提供，外植体材料采自甘肃省武威市凉州区张义镇堡子村，冰盒保存带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 无菌外植体的建立 接种之前对材料进行彻底的消毒处理。自来水冲洗2h，置于超净工作台，剪成1cm的单芽茎段，75%乙醇浸泡20s，无菌水洗2遍，滤纸吸干水分；浸于0.1%升汞7min，无菌水洗6次；将进行表面灭菌消毒后的材料接种在 MS＋30 g/L蔗糖的培养基上，及时去除或转接污染材料。

1.2.2 茎尖剥离、接种及培养 研究初期借鉴了陆瑞菊等［5］的研究方法。，预先在35℃的培养箱对瓶苗热处理1个月。在无菌条件下，剪取0.5～0.7cm长的茎尖，接种到MS培养基上。待茎尖成活后，再在解剖镜下剥取0.2mm的茎尖接种到添加1.0mg/L的6－BA和0.05mg/L NAA的启动培养基上。25℃，光强3 000lx、每天光照16h/d、黑暗8h/d的光周期下培养。连续5代重复此高温加剥茎尖培养法以期获得人参果脱毒苗。

1.2.3 病毒检测及植株快繁复壮 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS－ELISA），对第5代高温脱毒试管苗进行检测，所涉及CMV，TMV及PVM病毒包被抗体和酶标抗体均购自英国安德珍（ADGEN）生物技术有限公司。根据测定的吸光度，求出被测样品光密度值（P）与标样（健康材料）光密度值（N）比值（P/N）。结果判定：P/N＜1.5者，为阴性（几乎不带毒）；P/N介于1.50～1.99者，为轻度带毒材料；P/N≥2.0者，则为带毒材料。将检测合格的试管苗接种在1/2MS培养基＋0.5mg/L NAA培养基上扩繁复壮。

1.2.4 再生体系建立与优化实验设计 以MS为基本培养基，愈伤诱导培养基采用L9（34）正交设计，共9个处理，每处理重复3次，每个重复为4盘，每盘接入5个脱毒苗茎段或叶缘剪伤叶盘。各因子及水平见表1，观察记录愈伤诱导结果，使用DPS进行数据处理。

分化培养基采用正交设计L9（34），共9个处理，每处理重复3次，每重复为4个培养至0.5～1.0cm2大小的茎段或叶盘愈伤，各因子及水平见表2，观测统计各处理诱导分化丛生芽的结果，使用DPS进行数据处理。

生根培养基采用完全随机设计，以1/2MS（大量元素减半）为基本培养基，在4种不同配比的生根培养基 （H 15g/L 蔗糖；I 15g/L 蔗糖 ＋0.5mg/L NAA；J 15g/L蔗糖＋1.0mg/L NAA；K 30g/L 蔗糖）上各转接40个分化得来的单芽茎段，观察统计各处理生根情况。

表1 愈伤诱导培养基因素与水平Table 1 Treatments and level design of callus mediums

表2 分化培养基因素与水平Table 2 Treatment and level design of differentiation mediums

2 结果与分析

2.1 高温茎尖脱毒结果

鉴于大田中人参果采用扦插的方式繁殖，植株产生不定芽和不定根的能力很强，因此，在外植体初代培养时选用基本MS培养基，单芽茎段单瓶接种120瓶（表3），成活97株，污染率达19.1%，在今后的实验中应考虑适当延长升汞处理时间。

实验室原组培苗及外植体材料共120瓶，高温茎尖脱毒结果见表3。剥取0.5～0.7cm大小的茎尖，接种7d后，继续剥取0.2mm茎尖，成活的茎尖在一周后逐渐变绿，基部逐渐增大，形成少量愈伤样组织，1个月可见明显伸长的小茎，2个月可成苗。研究发现，随着茎尖剥离代数的增加，多次经过高温逆境的锻炼，茎尖成活率有所上升，可接近75%。另外，适当的间断变温处理更有利于茎尖成活和病毒脱除。

表3 接种情况Table 3 Inoculate situation

2.2 病毒检测结果

对随机取样的10份第5代试管苗的ELISA病毒检测（表4），结果显示只有1份材料轻微带毒（P2），其余均为阴性，充分说明高温脱毒方法可行性极高。实验对检测合格的9份材料进行了扩繁复壮，为后续再生体系建立做好了准备。

2.3 再生体系建立

2.3.1 愈伤组织诱导培养基的筛选 分别以脱毒苗茎段和叶盘为材料，以MS为基础培养基，采用正交实验设计对6－BA，ZT和2，4－D浓度配比进行了筛选，愈伤组织诱导结果见表5。研究发现，人参果再生能力很强，无论叶片还是茎段均能成功诱导出Ⅱ型愈伤组织，诱导结果显示，L6（A2B3C1：1mg/L 6－BA＋1.6 mg/L ZT＋0.2mg/L 2，4－D）为最佳培养基激素组合，适宜浓度的2，4－D的诱导效应要强于6－BA及ZT。对叶盘诱导25～35d，即可见围绕受伤叶缘产生黄白色颗粒状愈伤，愈伤生成基数大，但后期生长较缓慢（图1－A）；对茎段诱导20～30d，即可见先两端后中间产生黄白色团状愈伤，后期体积增大快、生长旺盛（图1－B），但Ⅰ、Ⅱ型愈伤组织混合生长（图1－C），若及时转接至L6培养基上，Ⅰ型愈伤会向Ⅱ型转化。茎段诱导产生愈伤所需时间短，愈伤质量好，且愈伤诱导率总体高于叶盘，但受伤叶片沿叶缘形成的愈伤点多，虽然较分散，生长较慢，只要在诱导40d后，继代转接至L6培养基，进行暗培养，愈伤生长速度也会明显加快。

表4 人参果病毒抽样检测结果Table 4 Sampling detection of pepino virus

图1 愈伤诱导情况Fig 1 The situation of callus induction

表5 不同培养基愈伤诱导结果Table 5 The result of callus induction for different mediums

2.3.2 分化培养基的筛选 将培养至0.5～1.0cm2大小的愈伤组织转入不同6－BA、IAA、GA3和ZT浓度配比的分化诱导培养基中，光照培养，进行丛生芽诱导，45d统计平均成芽数及诱导率，DPS处理分析结果见表6。

实验筛选出最佳的分化培养基激素配比方案为F4（D2E1F2G3：2mg/L 6－BA＋0.1mg/L IAA＋1 mg/L GA3＋2mg/L ZT），愈伤分化率均达100%，且单块愈伤最高平均分化可达13.42个不定芽。总体来看，适宜的6－BA浓度对分化的影响最为显著，生长素与分裂素的比例也至关重要，各个处理间差异性较为显著。叶盘诱导出的愈伤组织转绿快，丛生芽点多，成芽所需天数少，分化率明显高于茎段，但前期不定芽生长较缓，芽弱，可作为转基因研究中遗传转化部分的良好材料（图2－D）；茎段诱导出的愈伤部分转绿，丛生芽分化率相对较低，出芽部位多在愈伤顶端，但不定芽长势较壮（图2－E），且部分可自行长出根系，可作为离体快繁的良好材料（图2－F）。

图2 愈伤分化情况Fig.2 The situation of callus differentiated

表6 不同培养基愈伤组织分化结果Table 6 The result of Calli differentiated for different mediums

2.3.3 生根培养基的优化 生产中，人参果植株扦插即可成活，组培苗在MS培养基中即可生根，但所需时间较长，生长速度较慢。实验对生根条件进行了优化（表7），将丛生不定芽转接在I组，即1/2MS＋15g/L蔗糖＋0.5mg/L NAA培养基中，只需3～4d即可生根，后期根系发达，且有助于叶腋处侧枝生长，可大大节约组培快繁时间，且明显提高出瓶移栽成活率。

表7 生根培养基的优化结果Table 7 The optimizing of rooting mediums

3 讨论

人参果外植体接种到培养基污染率的高低与取材部位及消毒是否彻底有很大关系。研究参照陆瑞菊［5］的方法，采用连续5代35℃高温热处理加剥茎尖培养的方法，获得了人参果脱毒试管苗，对随机抽样的脱毒试管苗采用酶联免疫法进行病毒检测，脱毒率达90%，说明通过茎尖脱毒培养和快速繁殖的确是生产人参果无病毒种苗的有效途径。

愈伤组织的诱导是非常复杂的生理、生化过程，每一步都受到生长物质的调控。高浓度的生长素和细胞分裂素配比有利于愈伤组织的诱导，而低浓度配比则有利于愈伤组织的分化［9］。对于人参果再生体系建立的研究，翟进升［10］认为适于茎尖愈伤组织形成和分化的培养基为 MS＋0.2mg/L NAA＋2.0mg/L 6－BA。研究采用正交实验设计，对于人参果愈伤诱导及分化的激素配比进行优化研究，筛选出最适人参果愈伤诱导的配方为1mg/L 6－BA＋1.6mg/L ZT＋0.2mg/L 2，4－D，适合分化诱导的配方为2mg/L 6－BA＋0.1 mg/L IAA＋1mg/L GA3＋2mg/L ZT。诱导出的Ⅱ型愈伤组织结构紧密，增殖速度较快，分化状况良好。研究还对茎段和受伤叶片的诱导及分化效果做了比较，发现各有所长。叶盘诱导出的愈伤组织转绿快，丛生芽点多，成芽所需天数少，前期不定芽生长较缓，芽弱，可作为转基因研究中遗传转化部分的良好材料；茎段诱导出的愈伤部分见光转绿，丛生芽分化率相对叶盘较低，出芽部位多在愈伤顶端，不定芽生长较壮，且部分可自行长出根系，可作为离体快繁的良好材料。另外，光培养条件下将愈伤组织转入愈伤诱导培养基也可见愈伤组织生长变绿并分化出丛生芽，但极缓慢，同样条件下转入分化培养基2mg/L 6－BA＋0.1 mg/L IAA＋1mg/L GA3＋2mg/L ZT上，分化出的丛生芽长势较快。暗培养条件下将愈伤组织转入愈伤诱导培养基进行继代培养，增殖较快，但会出现褐化问题。若能及时转入低浓度培养基0.1mg/L 2，4－D＋1 mg/L 6－BA，即可有效减轻褐化问题。暗培养增殖的愈伤一经见光即可产生绿色芽点，转入分化培养基后分化出的丛生芽，长势整齐、旺盛。剪取不定芽接入1/2MS培养基＋15g/L蔗糖＋0.5mg/L NAA的培养基上，生根快，植株长势健壮，可有效提高移栽成活率。

实验研究充分发挥了正交设计法的优势，建立并优化了人参果植株脱毒及再生体系，较大的提高了实验效率，不仅为人参果脱毒及工厂化育苗提供了依据，而且为今后转基因研究的遗传转化工作奠定了良好的基础。

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