光叶紫花苕种子贮藏蛋白分析

柳 茜，王清郦，傅 平，孙启忠，敖学成

（1.四川省凉山州畜科所，四川 西昌 615042；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010）

光叶紫花苕（Vicia villosavar.glabresens）为一年生草本植物，原产于美国俄勒冈州，20世纪40年代自美国引进南京，现广泛种植于安徽、山东、河南、湖北、云南、四川、贵州等省［1］。光叶紫花苕适应性广，耐寒，耐旱，在田间、果园、山坡、生荒地上均可种植［2］。光叶紫花苕具有较高的饲用价值，粗蛋白含量在20%以上，氨基酸、矿物质、维生素含量比较丰富，是牛、猪、鸡的优质饲料［3－7］。此外，光叶紫花苕还是良好的绿肥和覆盖作物，能改良土壤肥力，提高土壤固氮能力以及后续作物的产量和品质［8，9］，同时也是良好的蜜源植物［2］。凉山光叶紫花苕（Vicia villosavar.glabresenscv.Liangshan）是凉山州从云南引进的光叶紫花苕在长期推广中选育出的地方品种，适应性强，在海拔2 500～3 200m的地区都能种植［3］，是高寒山区冬春季节的优质牧草。

种子贮藏蛋白是植物体中一类表达率高、能在种子内大量积累且不易降解的蛋白质［10］。贮藏蛋白可分为醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白等，这些蛋白质的组成由遗传决定，不受环境影响，其组分上的差异可以反映出基因型的不同，因而被称为品种的生化“指纹”［11］。研究种子贮藏蛋白的方法有多种，其中蛋白质电泳谱带具有较高的多态性、专一性和稳定性，在植物的遗传生化标记、品种鉴定、种群（居群）间的遗传变异以及遗传结构的研究等方面得到广泛应用［12，13］。试验采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）技术对凉山州境内5个居群的光叶紫花苕的种子贮藏蛋白进行研究，从生化水平上探讨凉山光叶紫花苕的遗传多样性，为凉山州种质资源的研究和开发利用提供技术参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料采自凉山州境内的西昌、盐源、普格、普格小兴场和德昌5个地区光叶紫花苕的自然居群。每个居群随机选取5个单株混合作为该居群的样品。各居群的生态因子情况见表1。

1.2 试验方法

参照文献［14］SDS－PAGE垂直平板电泳方法，分别对各居群种子贮藏蛋白（清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和盐溶蛋白）及总贮藏蛋白进行电泳，并分析其多态性。

表1 光叶紫花苕居群的样品来源Table 1 The Source of Vicia villosa Roth var.glabrescens cv.Liangshan samples

1.2.1 种子贮藏蛋白的提取 取10粒种子洗净擦干，放入研钵中研碎，置于1.5mL离心管中，加入蛋白提取液［15－18］。

①清蛋白提取液：去离子水500μL。

②盐溶蛋白提取液：加200μL脱脂剂（氯仿∶甲醇∶丙酮＝2∶1∶1），振荡混匀，脱脂2h（室温），10 000 r/min离心10min，弃上清液后风干，加入500μL盐溶蛋白提取液（0.25mmol/L Na3PO4、2mol/L NaCl，pH ＝7.0）。

③醇溶蛋白提取液：75%乙醇溶液500μL。

④谷蛋白提取液：0.2%NaOH溶液500μL。

⑤贮藏蛋白提取液：5mL 10%SDS，1.5mL 2－ME，1.25g溴酚兰，3.44mL 甘油，2.0mL 1mol/L Tris－Hcl pH 6.8，加双蒸水定容到25mL；500μL。

室温振荡浸提2h，10 000r/min离心10min，取上清液置于4℃冰箱备用。以1∶1的比例加入上样缓冲液，煮沸5min后点样。

1.2.2 SDS－PAGE电泳 SDS－PAGE的浓缩胶浓度3%，分离胶浓度12%。各类贮藏蛋白及总的贮藏蛋白的上样量10μL，标准蛋白D532S（分子量6.5～200 kDa），上样量5μL，用北京六一电泳仪器厂DYZ－28B型电泳槽，浓缩时电压恒压200V，分离时电流恒流60 mA电泳，室温下电泳7～8h至指示剂跑到距底部1cm处，电泳结束后剥下胶片，染色3～10h，脱色至条带清晰为止，照相并进行统计［18］。

1.3 统计分析

SDS－PAGE中蛋白单体分子量的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关，单体电泳迁移率与其蛋白单体分子量的关系为lgMW＝lgK－bm＝K1－bm。其中MW为蛋白单体分子量，m为蛋白单体迁移率，K，K1和b为常数。相对迁移率（Rf）＝脱色后蛋白质移动距离×染色前分离胶长/染色前指示剂移动距离×脱色后分离胶长。根据已知分子量的标准蛋白（Marker）在相同电流条件下的迁移率，作出分子量和迁移率的标准曲线，然后计算出待测蛋白单体的分子量。

根据电泳结果对清晰蛋白质条带的有无进行标记，有为1，无为0，得出（0，1）矩阵。利用 Popgene 1.31软件进行Nei’s遗传距离（D）和遗传一致度（I）分析。利用NTSYS－pc 2.1系统进行聚类分析［19］。

2 结果与分析

2.1 贮藏蛋白谱带遗传多样性分析

利用SDS－PAGE对5个不同居群的光叶紫花苕种子贮藏蛋白进行电泳，获得清晰稳定的遗传蛋白图谱（图1）。

图1 5个不同居群光叶紫花苕的贮藏蛋白电泳图谱Fig.1 Electrophoregrams of seed storage proteins of 5 populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

5个居群之间的贮藏蛋白谱带存在差异，共检测到31条蛋白谱带，其中，11条谱带为共有带，包括第3号、7号、8号、14 号、16 号、22 号 、25 号 、26 号、28 号、30号、31号；其余20条为不同程度表达的多态性谱带，多态性数目占总条带的65.52%。西昌居群有19条带，盐源居群有22条带，普格小兴场居群有20条带，普格居群有17条带，德昌居群有22条带。普格小兴场居群有1条特有带，德昌居群有8条特有带。谱带分子量在11.09～100.09kDa，相对迁移率在0.16～0.84。根据谱带相对迁移率由小到大（分子量由大到小），将种子贮藏蛋白图谱分为α、β、γ、ω区域。其中α区相对迁移率为0.7～1.0，β区相对迁移率为0.3～0.7，γ区相对迁移率为0.1～0.3，ω区相对迁移率为0～0.1。贮藏蛋白只在α、β、γ区域有条带出现，其中α区有6条，β区有19条，γ区有6条，ω区无谱带出现，表明光叶紫花苕种子贮藏蛋白主要集中在β区。

表2 5个不同居群光叶紫花苕贮藏蛋白电泳各谱带的迁移率和蛋白分子量Table 2 Frequency of bands and molecular weight of seed storage proteins of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

光叶紫花苕5个居群贮藏蛋白的Nei’s的遗传距离和遗传一致度见表3，西昌与盐源居群、普格小兴场与普格居群的遗传距离最小，均为0.101 8，普格小兴场与德昌居群遗传距离最大，为0.869 0；普格小兴场与德昌居群遗传一致度最小，为0.419 4，西昌与盐源居群、普格小兴场与普格居群的遗传一致度最大，为0.903 2。

5个居群的贮藏蛋白谱带遗传相似系数在0.13～0.90，平均达0.60，遗传相似性较高，表明遗传多样性较低，遗传基础较窄。居群1与2、3与4谱带相似系数最高，达到0.90，说明居群间亲缘关系较近；居群5与1、2、3、4号居群的遗传相似系数小，分别为0.21、0.27、0.13、0.34，表明居群间亲缘关系较远。从聚类分析结果可以看出（图2），在遗传相似系数为0.47时5个居群分为2大类，第1类为1、2、3、4号居群，5号居群单独聚为1类。

表3 贮藏蛋白Nei’s遗传一致度（右上角）和遗传距离（左下角）Table 3 Nei＇s of genetic identity and genetic distance of seed storage proteins

图2 5个居群光叶紫花苕的贮藏蛋白聚类图Fig.2 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

2.2 盐溶蛋白谱带遗传多样性分析

5份供试材料的盐溶蛋白谱带存在差异，共检测出22条蛋白谱带，其中13条谱带为稳定表达谱带，表达率为100%；其余9条为不同程度的多态性谱带，多态性数目占总条带的40.92%（图3）。5（德昌居群）有8号、14号两条特有谱带，1（西昌居群）有17号1条特有谱带。其中α区有5条，β区有12条、γ区有5条，ω区无谱带出现，分子量大小13.50～95.04kDa（表4）。

5个不同居群光叶紫花苕盐溶蛋白的Nei’s的遗传距离和遗传一致度见表5，2（盐源居群）与4（普格居群）的遗传距离为0最小，5（德昌居群）与2（盐源居群）、4（普格居群）的遗传距离最大，为0.452 0；5（德昌居群）与2（盐源居群）、4（普格居群）的遗传一致度最小（0.636 4），4（普格居群）与2（盐源居群）的遗传一致度最大（1.000 0）。

图3 5个不同居群光叶紫花苕的盐溶蛋白电泳图谱Fig.3 Electrophoregrams of salt－soluble proteins of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

表4 5个不同居群光叶紫花苕盐溶蛋白电泳各谱带的迁移率（Rf）和蛋白分子量Table 4 Frequency of bands and molecular weight of salt－soluble proteins of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

表5 盐溶蛋白Nei’s遗传一致度（右上角）和遗传距离（左下角）Table 5 Nei＇s of genetic identity and genetic distance of salt－soluble proteins

5个居群的盐溶蛋白谱带遗传相似系数在0.55～1.00，平均达0.78，谱带相似系数最高的是居群2与4，达到1.00，居群间亲缘关系最近；居群5与2、4号居群的遗传相似系数较低，为0.55，居群间亲缘关系最远。从聚类分析结果可以看出（图4），在遗传相似系数为0.66时5个居群分为2大类，第1大类又可分2个亚类，2、3、4号居群聚为1类，1号居群单独为1类。5号居群单独聚为第2大类。

2.3 清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白电泳结果

经电泳染色脱色后，点样孔加入醇蛋白的泳道无清晰谱带出现，点样孔加入清蛋白、谷蛋白的泳道中出现几条痕迹很浅的条带，由于蛋白含量过少故对此不做过多讨论。

图4 5个不同居群光叶紫花苕的盐溶蛋白聚类图Fig.4 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of 5 Vicia villosa var.glabresens cv.Liangshan

3 讨论与结论

SDS－PAGE凝胶电泳的电泳速度与蛋白分子量大小有关而与电荷和形状无关。因其具有电泳结果稳定、不受贮藏年限和外界环境影响等优点而得到广泛应用［20］。李拥军等［20］利用SDS－PAGE方法对我国18个苜蓿地方品种和北美9个苜蓿基本种质来源的代表品种及14份豆科牧草种（品种）种子贮藏蛋白进行了分析，结果表明贮藏蛋白谱带差异较小；闫伟红等［21］对引种栽培筛选出的5种12个冰草属植物居群醇溶蛋白进行遗传结构分析，发现同一物种不同来源材料间遗传差异较小。

对5个不同居群光叶紫花苕的蛋白电泳谱带进行统计，不同提取液所获得的蛋白谱带各不相同。其中使用75%乙醇溶液提取的种子醇溶蛋白含量甚微或无，使用去离子水和0.2%NaOH溶液提取的种子清蛋白和谷蛋白只出现几条痕迹很浅的条带。利用盐溶蛋白和贮藏蛋白提取液所得的总蛋白谱带的分子量介于11.09～100.09kDa，相对迁移率在0.17～0.90。盐溶蛋白的蛋白谱带总数为22条，多态率为40.92%；贮藏蛋白的为31条，多态率为65.52%，说明5个居群的盐溶蛋白的条带位点少于贮藏蛋白，种内变异小于贮藏蛋白。聚类结果表明，利用盐溶蛋白和贮藏蛋白获得的蛋白质图谱能区分鉴别5个不同居群的光叶紫花苕。供试材料分为2类：1）西昌、盐源、普格小兴场、普格居群；2）德昌居群。表明同一物种不同生态居群的遗传差异较小，与闫伟红研究结果相似［21］。凉山光叶紫花苕具有较高的遗传保守性，在不同生态区都能保持较稳定的遗传性，这可能与光叶紫花苕为自花授粉植物有关。德昌居群种子千粒质量比其他居群小，但植物学特性表现一致，是否是光叶紫花苕新类型，还需要结合其他手段做进一步的研究证明。

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