双孢蘑菇工业化生产液体菌种繁育条件的优化*

宋德龙，贠建民，艾对元，张紊玮，魏龙

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)

我国双孢蘑菇产量和出口量居世界第一位，但目前生产方式仍比较落后［1－3］。菌种生产多采用固体逐级扩大培养方式，菌种的纯度低、生长周期长、菌龄不一致，且菌种生产成本较高。随着食用菌栽培工厂化进程的不断推进，这种食用菌制种方式已不能满足其规模化的高效栽培需要，而深层发酵技术则可以解决以上问题［4－7］。近几年，我国液体菌种生产伴随着食用菌工业化的发展也取得了很大的进步［8］，但在西北地区食用菌液体菌种生产与应用还存在着一些制约因素，诸如液体菌种生产过程对无菌程度控制要求很高、对设备的依赖性和投入较大、对操作人员的技术素养要求也较高，存在的染菌风险也相应高［9］。为适应新形势下的食用菌大规模工厂化栽培的需求，特别是液体菌种均匀化喷洒播种模式的要求，本文拟对双孢蘑菇As2796菌株进行液体振荡培养，通过优化液体菌种培养基组成和培养条件，有效控制液体菌种菌丝球的直径和密度，旨在获得一种适合于双孢蘑菇工厂化生产中可进行管道自动化喷洒播种的液体菌种，为双孢蘑菇工厂化生产制备液体菌种提供理论依据，并为食用菌栽培提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

双孢蘑菇(Agaricus bisporus imbach)As2796菌株，由兰州科泰现代农业科技有限公司提供。

1.2 培养基配方

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、琼脂20 g、水1 000 mL，pH 自然，用于菌种斜面培养。

查阅文献资料和企业多年生产验证的配方［10－11］，获得以下4种一级液体种子培养基:

(1)MgSO4· 7H2O 0.5 g、KH2PO40.46 g、K2HPO41 g、蛋白胨 2 g、酵母浸膏 2 g、葡萄糖 20 g、水1 000 mL，pH自然;

(2)玉米淀粉 30 g、蔗糖 20 g、酵母粉 5 g、Mg-SO4·7H2O 1 g、KH2PO41.5 g、VB10.01 g、水 1 000 mL，pH 自然;

(3)马铃薯80 g、红糖 12 g、葡萄糖 9.0 g、蛋白胨 2 g、酵母膏 1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、VB10.01 g、水 1 000 mL，pH 自然;

(4)玉米淀粉 30 g、蔗糖 20 g、蛋白胨 5 g、Mg-SO4·7H2O 1 g、KH2PO41.5 g、VB10.01 g、水 1 000 mL，pH 自然;

二级液体种子培养基［10］:玉米淀粉31.7 g、豆饼粉 11.3 g、MgSO4·7H2O 3.5 g、KH2PO42.5 g、CaCl27.5 g、NaCl 6.5 g、水 1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 培养方法

1.3.1.1 菌种活化

从保藏的斜面试管菌种中切出1 cm2大小的菌种块接种于PDA斜面的中部，25℃恒温培养25 d。

1.3.1.2 一级液体种子培养

将活化的母种分割成约2 cm2大小的菌块，接种到液体培养基中，一个250 mL三角瓶接2块菌种，先在25℃静置48 h，然后振荡培养7 d左右，获得一级液体种子(摇瓶菌种)。摇瓶培养条件:250 mL三角瓶装液量100 mL，在25℃，150 r/min的摇床上培养7 d左右。

1.3.1.3 二级液体种子培养

将摇瓶菌种在25℃静置48 h后，用均浆器将其均浆。250 mL三角瓶装入二级液体种子培养基100 mL，接入10%一级液体种子，在25℃，150 r/min的摇床上振荡培养14 d左右。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 菌丝球生物量的测定［12］

摇瓶培养结束后，将发酵液置于离心机中，3 000 r/min离心20 min，取沉淀用分析天平称重。

1.3.2.2 菌丝球直径的测定［3，10］

随机取菌丝球20个，成直线排列，测其总长度，重复3次，取平均值。

1.3.2.3 菌丝球密度的测定［10］

取5 mL的发酵液，按比例在量筒中加水稀释，摇匀后取1 mL在直径9 cm的培养皿中摊匀，培养皿下垫黑白相间的格纸，用方格计数法计数。

1.3.2.4 pH值的测定

取培养液，采用精密pH计直接测量。

1.3.2.5 还原糖的测定［13］

3，5-二硝基水杨酸法(DNS)测定。

1.3.2.6 氨基氮的测定［13］

用甲醛滴定法测定。

1.3.3 液体菌种繁育条件优化设计

1.3.3.1 一级液体种子培养基的筛选

从1.2所列4种培养基配方中优选一级液体种子培养基，每个培养基做3个重复，相同条件下摇床培养，通过观察记录液体菌种的菌丝萌发的速度、培养液澄清度、菌丝球大小和数量、杂菌污染、菌丝球生物量等情况，从而优选摇瓶菌种培养基。

1.3.3.2 二级液体种子培养条件单因素试验

对液体培养条件温度、初始pH、接种量、装液量进行单因素筛选试验，考察各因素对双孢蘑菇液体菌种培养的影响，以确定最适单因素条件。

1.3.3.3 二级液体种子培养条件正交试验

在单因素试验基础上，从每个影响因素中选出对液体菌种繁育影响最大的3个水平，采取正交表L9(34)安排正交实验(表1)，以菌丝体生物量为指标。

表1 培养条件正交试验设计Table 1 Orthogonal designs of culture conditions

1.3.3.4 液体菌种培养周期的确定［13］

在上述研究结果基础上，对液体制种过程中培养液的各主要理化指标变化进行动态跟踪，从接种后第3天开始取样测定，每2天测1次，主要测量指标为生物量、还原糖、pH值、氨基氮，每次做3个重复，取平均值。

2 结果与分析

2.1 双孢蘑菇一级液体种子培养基不同配方的筛选

双孢蘑菇一级液体种子培养基不同配方的菌丝生长情况见表2。

表2 双孢蘑菇一级液体种子培养基不同配方的菌丝生长情况Table 2 Mycelium growth of Agaricus bisporus Primary liquid seed in different medium formulations

从表2可以看出，双孢蘑菇在4种液体种培养基配方中均可生长。菌丝生物量分别为:(1)13.969 mg/mL，(2)25.408 mg/mL，(3)37.610 mg/mL，(4)19.203 mg/mL。其中配方(3)效果较好，菌丝萌发快，菌丝球多而均匀，更适合做液体种子;配方(2)次之;而配方(1)和配方(4)则较差，菌丝量少且不均匀。

2.2 双孢蘑菇二级液体种子培养单因素试验分析

2.2.1 温度对菌丝球生物量、菌丝球直径及菌丝球密度的影响

由图1可知，随着温度的升高，菌丝体生物量先增加后下降。25℃时菌丝体生物量最大，超过25℃，菌丝体的生物量逐渐下降。由图2可以看出，随着温度的升高，菌球直径与菌球密度都是呈现先增长后下降的趋势。这是由于在液体培养过程中，随着温度的上升，菌体衰老加快［12］，而温度过低时，又不利于菌丝体生长。

图1 温度对生物量的影响Fig.1 Effect of temperature on biomass

图2 温度对菌球直径、菌球密度的影响Fig.2 Effect of temperature on diameter and density

另外，在本试验供试装液量和摇床转速条件下，25℃时菌球直径最大，超过25℃后逐渐下降;22℃时菌球密度达到最大值，随后逐渐降低。综合考虑，选用温度 22、25、28℃。

2.2.2 初始pH值对菌丝球生物量、菌丝球直径及菌丝球密度的影响

由图3可知，初始pH值对菌丝球生物量的影响呈现上升后下降趋势，当初始pH值为6.5时，菌丝体生物量最大，达到135.727 mg/mL。

图3 pH值对生物量的影响Fig.3 Effect of pH on biomass

由图4可以看出，菌球直径随pH值增大逐渐变大，而菌球密度随pH值增大逐渐明显下降。

图4 pH值对菌球直径、菌球密度的影响Fig.4 Effect of pH on diameter and density

初始pH为6.0～6.5时，菌球直径恰当，为1.7～1.8 mm，菌球密度较为适中，为39个/mL。这是由于真菌生长的最适pH一般是中性偏酸，在6.0左右［14］，过高或过低都不利于菌丝体生长。因此做正交试验时选用pH值为5.5、6.0、6.5。

2.2.3 接种量对菌丝球生物量、菌丝球直径及菌丝球密度的影响

由图5可知，当接种量为6% ～12%时，菌丝体生物量随着接种量的增大而增多;接种量为12%时，生物量达到最大128.6 mg/mL。由图6可以看出，随着接种量的增大，菌球直径先减小后增大，而菌球密度先升高后降低;当接种量大于10%后，菌球直径变大，菌球密度反而随接种量的增大而减小。这是由于在固定容积，同一营养水平下，随着接种量的增大，菌体之间的营养竞争也相应地增大，生长周期减短，提前进入衰亡期，以致菌球数量减少［15］。综合考虑，选用接种量为8%、10%、12%。

图5 接种量对生物量的影响Fig.5 Effect of inoculum volume on biomass

2.2.4 装液量对菌丝球生物量、菌丝球直径及菌丝球密度的影响

由图7和图8可以看出，装液量为100 mL时菌体生长情况最好，通常装液量与培养基中的溶氧量成反比，装液量多则培养基中的溶氧量就会相应地减少［10］。随着装液量的进一步增加，溶氧量降低导致菌体的生长变得缓慢，菌球密度降低，菌球直径变大。所以选用装液量为80 mL、100 mL、120 mL。

图6 接种量对菌球直径、菌球密度的影响Fig.6 Effect of inoculum volume on diameter and density

图7 装液量对生物量的影响Fig.7 Effect of volume on biomass

图8 装液量对菌球直径、菌球密度的影响Fig.8 Effect of volume on diameter and density

2.3 双孢蘑菇二级液体种子培养条件正交试验分析

基于2.2单因素所得的最佳条件，采用正交表L9(34)安排正交试验，试验结果见表3。

表3 培养条件优化正交试验结果与分析Table 3 Analysis of orthogonal experiment for culture conditions optimization

续表3

为检验各因素对菌丝球生物量的影响程度，首先做生物量方差分析，结果见表4。

表4 菌丝球生物量方差分析Table 4 Analysis of variance on biomass

通过表4方差分析，结果表明，在0.05的显著水平下，装液量对双孢蘑菇菌丝体生物量的影响不显著，而温度、初始pH及接种量对菌丝体生物量均有显著影响。

表5 菌丝球生物量极差分析Table 5 Analysis of range on biomass

由表5极差分析结果可知:在试验取值范围内，影响因素中对生物量影响最大的是温度(R=48.9)，其次是初始pH(R=37.4)，再次是接种量(R=34)，而对生物量影响最小的是装液量(R=6.9)。从极差分析表中可以得出每个因素的最佳水平，将其组合在一起即为最优组合:培养温度25℃、初始pH 6.0、接种量12%、装液量100 mL。

由于在表3正交试验中得出的菌丝体最高生物量的繁育条件为:培养温度25℃、初始pH 6.0、接种量12%、装液量80 mL，生物量达到242.1 mg/mL;而在极差分析结果中得出的最优组合为培养温度25℃、初始pH 6.0、接种量12%、装液量100 mL，二者不一致，故需通过验证实验进行比较，即在培养温度25℃、初始pH 6.0、接种量12%、装液量100 mL的条件下开展菌丝体液体繁育试验，测定菌丝体生物量、菌球直径及菌球密度，重复测定6次，结果见表6。

表6 最优组合下双孢蘑菇菌株的生物量、菌球直径及密度Table 6 Biomass，hypha global diameter and density of Agaricus bisporus under the optimal combination

在最优组合即培养温度25℃、初始pH 6.0、接种量12%、装液量100 mL的条件下，菌丝体生物量湿重平均值为249.6 mg/mL，折算成干重为25.0 mg/mL，菌球直径平均值为1.83 mm，菌球密度的平均值为65个/mL，高于在正交表3中得出的最高菌丝体生物量。

优化得到的繁育条件为:培养温度25℃、初始pH 6.0、接种量12%、装液量100 mL。菌球直径为1.5～2.0 mm，菌球密度为50～80个/mL，符合双孢蘑菇工厂化生产中可进行自动化喷洒播种的液体菌种要求。

2.4 双孢蘑菇二级液体种子最适培养周期试验分析

二级液体种子最适培养周期试验结果见图9。在双孢蘑菇液体菌种培养过程中，菌丝球生物量的变化符合微生物生长曲线，在第216 h达到最大值260.07 mg/mL，随后菌丝球的生物量保持相对稳定并开始逐步下降。这可能是由于菌丝体生长进入衰亡期而发生菌丝球自溶。

图9 摇瓶发酵过程中各理化指标的动态变化Fig.9 The dynamic variation of physical and chemical index in the submerged fermentation

液体培养过程中pH值的变化不大，但还是呈先下降后上升的趋势。pH值前期降低，是因为菌丝体在大量生长增殖过程中，消耗了碳源产酸所致，发酵终点期pH值上升，是因为菌丝体自溶，胞内蛋白外流造成。还原糖含量变化先升高后降低，在第168 h达到最大值10.7 mg/100 mL，随着发酵液中基质的大量消耗，使得还原糖的含量逐渐下降，在第216 h还原糖含量达到一个最低值为5.4 mg/100 mL，但仍高于发酵液内还原糖原始含量3.2 mg/100 mL，这充分说明菌丝体在生长过程中能够水解淀粉成为还原糖。216 h后，菌丝体开始进入稳定期和衰亡期，生长、增殖速度开始减慢，使得已水解的淀粉被利用的速度逐渐降低，还原糖的含量又有一个较弱的上升趋势。氨基氮含量在培养过程中呈波浪形变化，但在第72 h有一个明显的上升，之后随着培养时间的延长，其含量呈下降趋势。这也说明在液体菌种培养过程中菌丝体对氮源的利用是随着生物量的变化而变化的，与生物量呈负相关的关系。可选择第216 h为液体菌种培养终点，此时的菌丝球生物量及活性最高。

3 结论与讨论

有关食用菌液体菌种的研究及应用在国内外已有很多报道，大多数的研究都是基于通过对培养基及其培养条件的优化来提高食用菌菌丝体生物量。Marry等通过对双孢蘑菇菌丝体进行均质液体培养，探讨了均质液体培养对双孢蘑菇菌丝体生长状况的影响［7］。Kurbanoglu采用公羊角水解液作为营养基质对双孢蘑菇ATTC 10893菌株的菌丝体进行了深层液体培养，获得的菌丝体生物量干重达到10.8 mg/mL［17］。如罗帏通过对双孢蘑菇2796菌株液体菌种的工艺研究，其菌丝体生物量干重达到25.4 mg/mL［10］;马忠友通过优化双孢蘑菇液体菌种培养基配方，筛选到在黄豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，KH2PO40.05%，MgSO40.2%，麦麸0.2%组成的最优培养基配方下，菌丝体生物量干重达到6.45 mg/mL［18］。

本试验筛选出了以马铃薯为主要基质的一级液体种子培养基，结合玉米淀粉作为二级液体种子培养基，在优选培养条件下，不仅在菌丝体生物量上达到25.0 mg/mL，而且使菌球直径和菌球密度得到有效的控制，以便应用于液体菌种的工业化生产与工厂化栽培中的自动化播种。获得了如下结论:

(1)本试验通过对4种供试液体培养基的筛选，确定出了双孢蘑菇As2796一级液体种子的最佳培养基为:马铃薯80 g、红糖 12 g、葡萄糖 9 g、蛋白胨 2 g、酵母膏 1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、VB10.01 g、水 1 000 mL。

(2)运用单因素和正交试验组合优化的适合于双孢蘑菇工厂化喷洒播种的二级液体菌种繁育条件为:揺瓶转速 150 r/min、培养温度 25℃、初始 pH 6.0、接种量12%、装液量100 mL。在此条件下双孢蘑菇菌丝体生物量干重可达到25.0 mg/mL，菌丝球直径在1.5～2.0 mm，菌丝球密度为50～80个/mL。

(3)通过对最优条件下双孢蘑菇二级液体种子培养过程中的各理化指标进行动态跟踪测定，确定216 h为二级液体种子最适培养周期。

综上所述，本试验通过双孢蘑菇As2796菌株一级液体种子培养基筛选，以及二级液体种子繁育条件的优化，对双孢蘑菇工业化生产中液体菌种的生产条件进行了探索，为蘑菇工业化生产提供依据。

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