库拉索芦荟组织培养褐化现象的抑制研究

代建丽　宋婵婵　徐晨等

摘 要：褐化是芦荟组织培养中的普遍现象，严重影响组织培养的效果。以库拉索芦荟的茎段和叶片为外植体，研究了5种防褐剂活性炭、硝酸银、维生素C、L-谷氨酰胺和聚乙烯吡咯烷酮对愈伤组织诱导中褐化现象的抑制作用。结果表明，5种防褐剂都具有抑制外植体褐化的作用，其中15mg/L的AgNO3是最合适的防褐剂，其外植体褐化程度最轻，愈伤组织诱导率较高且愈伤组织生长良好。

关键词：库拉索芦荟；愈伤组织；褐化；防褐剂

中图分类号 Q949.71+8.23 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）06-23-02

库拉索芦荟（Aloe barbadensis）为百合科芦荟属多年生肉质植物[1]，其叶肥厚多汁，富含多种活性物质和营养元素，如维生素、多糖、蒽醌类化合物，叶肉粘胶物质占总叶重的65%～75%，3a以上老叶药效成分含量高，是药用、保健、美容的主要品种。库拉索芦荟的常规繁殖速度慢，主要利用组织培养技术进行快速繁殖，目前已经开展了一些研究[1-7]。研究的结果表明，茎尖和茎段更容易产生不定芽，叶片外植体难以诱导分化，但是所有的外植体在组织培养中都会发生褐化现象，严重时可导致外植体或分化的组织器官死亡[4-7]。褐化影响培养物的生长，不利于后期次生产物积累的研究和种苗的快速繁殖。笔者在培养基中添加了不同的防褐剂[6-9]，探讨防止外植体褐化的有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料 3a生库拉索芦荟，购于武汉雄楚大街花卉市场。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 取库拉索芦荟的茎和叶片在自来水下冲洗干净。选择幼嫩叶片抛开晾2h，然后在无菌条件下用75%的酒精消毒30s，0.1%升汞处理10min，无菌水洗涤5～6次，切成约0.5cm×0.5cm的小片，接种到培养基上进行培养。鳞茎用75%的酒精消毒30s，0.1%升汞处理15min，无菌水洗涤5～6次，切成约0.5cm×0.5cm×0.3cm的小块，接种到培养基上进行培养。

1.2.2 库拉索芦荟愈伤组织诱导培养基的筛选 以MS为基本培养基，采用4因素3水平的正交设计，其中KT设置1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L 3个水平，2，4-D设置0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L 3个水平，NAA设置0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L 3个水平，6-BA设置1.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L 3个水平，培养基中添加2g/L活性炭抑制褐化。将消毒后的茎和叶片外植体接种到培养基上，每瓶接种3个外植体，每处理3瓶。暗培养4d后24℃光照培养，2周后统计愈伤组织的诱导情况，连续统计3周，以最适培养基进行防褐化实验。

1.2.3 防褐化实验 以1.2.2的实验结果为参考，在MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L的愈伤组织诱导培养基中，分别加入2g/L活性炭、15mg/L硝酸银、0.2g/L维生素C（VC）、5mg/L L-谷氨酰胺、1.5g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP），组成5个防褐化处理，另设一组不加防褐化剂的空白对照，共6个处理。将消毒后的茎和叶片外植体接种到培养基上，每瓶接种4个外植体，每处理3瓶。低温8℃暗培养4d后，24℃暗培养3d，然后24℃弱光培养。每天观察外植体生长状态，2周后统计外植体的褐化情况及愈伤组织诱导率，连续统计2周。

2 结果与分析

将外植体接种到含有不同防褐化剂的培养基上培养，6d后外植体体积显著增大，除叶外植体的AgNO3处理外，其他处理均出现了褐化现象，褐化程度不一，以空白对照的褐化程度最为严重，茎外植体的褐化程度显著高于对应的叶外植体。转入弱光培养1周后，外植体色泽更绿而有光泽，4周渐渐有颗粒状愈伤组织形成，外植体转为黄绿色。3周时愈伤组织继续生长，4周时各处理的愈伤组织诱导率及褐化情况见表1和表2。

从表1和表2可以看出，在培养基中加入不同的附加物都可以有效抑制外植体的褐化，叶的褐化程度较茎轻。叶外植体的5种处理中，VC处理的愈伤组织诱导率最高，但外植体褐化率较高，导致形成的愈伤组织体积小；AgNO3和谷氨酰胺处理的外植体褐化率降低，愈伤组织诱导率处于中等水平，但AgNO3处理的愈伤组织生长迅速；活性炭和PVP处理的愈伤组织诱导率较低。综合各项指标，AgNO3是最合适的防褐化剂。茎外植体的5种处理中，VC处理的愈伤组织诱导率最高，愈伤生长状态较好，但外植体褐化率较高；AgNO3处理的外植体褐化率降低，褐化程度轻，愈伤组织生长迅速但愈伤组织诱导率较低；谷氨酰胺处理的外植体褐化率低，愈伤组织诱导率高，但愈伤组织体积小。综合各项指标，VC和AgNO3都是较适合的防褐化剂。

3 讨论

库拉索芦荟由于含有蒽醌类物质在培养中容易出现褐化现象。实验中加入的5种防褐化剂都可以减轻外植体的褐化，但效果不同，这是因为它们的作用机理不同。VC、AgNO3、L-谷氨酰胺属于抗氧化剂，其通过降低芦荟大黄酚等物质的氧化达到防褐化效果，而活性炭和PVP是吸附剂，是通过吸附蒽醌类物质达到防褐化效果。吸附剂在吸附褐化物质的同时，也可吸附培养基中的营养物质如激素，所以吸附剂的作用效果比抗氧化剂差。3种抗氧化剂中，VC和L-谷氨酰胺属于生物活性物质，AgNO3是重金属，所以AgNO3的防褐化效果虽好，但同时抑制了愈伤组织的形成，其愈伤组织诱导率均低于VC和L-谷氨酰胺。由于次生产物的提取和种苗的克隆需要大量生长状态良好的愈伤组织，培养中愈伤组织的褐化程度将是最关键的指标，愈伤组织诱导则可以通过扩大初代培养外植体的数目加以改善，因此，AgNO3适合作为库拉索芦荟组织培养的防褐化剂。

参考文献

[1]寥容. 美国芦荟组织培养研究[J]. 现代园艺，2012，11：3-4.

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[8]王颖，刘仁祥，聂琼，等. 不同防褐剂对烟草愈伤组织培养褐化现象的抑制效应[J]. 贵州农业科学，2012，40（1）：26-27.

[9]蔡建荣. 山药组织培养褐化反应的研究[J]. 中国农学通报，2008，24（8）：118-120. （责编：徐世红）