注射用特立帕肽对去卵巢大鼠骨质疏松的保护作用

张成广　刘启兵

【摘 要】为检测注射用特立帕肽对去卵巢大鼠骨质疏松动物模型的保护作用，评价其与进口制剂体内抗骨质疏松生物活性的一致性，选取健康Sprague Dawley大鼠，分别设立假手术组、模型组、注射用特立帕肽手术组，特立帕肽对照品手术组。连续给药16周后，评价其对实验动物大鼠各组胫骨密度值（bone mineral density，BMD）、股骨力学改变以及血清中ALP活力、钙磷含量变化的影响，结果表明注射用特立帕肽给药组可明显改善骨质疏松大鼠的骨密度及骨力学性能，部分逆转ALP活力的升高及血清钙磷的降低，且其体内抗骨质疏松活性与上市对照品基本一致，提示注射用特立帕肽在动物体内有较好的抗骨质疏松活性。

【关键词】注射用特立帕肽；骨质疏松；去卵巢；大鼠

【中图分类号】R977 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）06-0010-02

骨形成促进药在骨质疏松治疗中的地位越来越受到关注，特别是对于老年人和骨量低的人群，更需要用促进骨形成的药物来增加骨量。特立帕肽（Teriparatide）商品名为Forteo，由礼来公司研制开发，2002年12月在美国首次上市，为重组人甲状旁腺激素（rhPTH ）1-34，与内源性PTH类似，可与特异性高亲和性细胞表面受体结合发挥生物学作用[1]。动物实验表明，本品一日1次给药对成骨细胞的刺激作用高于其对破骨细胞的作用，可引起小梁骨和皮质骨表面的新骨生成[2]。

海南双成制药有限公司采用固相合成的方法制备了特立帕肽原料药，并采用冻干工艺制备了可供皮下注射的注射用特立帕肽（Teriparatide for injection），但自行制备的注射用特立帕肽的体内生物活性即对动物骨质量和生物力学性能的影响如何尚未加以确认。

依据药品审评中心2007 年9 月《合成多肽药物药学研究技术指导原则》[3]， 为更好验证注射用特立帕肽的体内生物活性，我们利用大鼠双侧卵巢摘除（OVX）致骨质疏松症模型，以上市原研产品为对照，对实验动物大鼠各组胫骨密度值（bone mineral density，BMD）、股骨力学改变以及血清中ALP活力、钙磷含量变化进行了比较，考察了注射用特立帕肽抗骨质疏松的体内活性，并验证其与上市原研产品活性的一致性，为进一步评价其临床疗效提供了数据支持。

1 材料

1.1药物

注射用特立帕肽：海南双成药业提供，批号分别为20100601、20100602、20100603，规格：20g；特立帕肽对照品：Eli Lilly and Company的上市產品Forteo，规格：600mg/2.4ml。

1.2实验动物

健康Sprague Dawley大鼠，体重（250±35）g左右，雌性，SPF级，购自浙江省医学科学院实验动物中心。按照清洁级别饲养管理，自由饮用消毒自来水，饲料为标准颗粒饲料，黑白光照各12小时，自由活动。

1.3主要试剂及仪器

0.9%注射用生理盐水（国药准字：H33021037）、10% 水合氯醛；电子天平、 注射器、手术器械、骨密度测量仪（美国GE Lunar公司）、Zwick/Roell骨力学测量仪。

2 实验方法

2.1实验动物分组及给药剂量

实验大鼠48只，随机分为6组，分别设立假手术组、模型组、注射用特立帕肽手术组，特立帕肽对照品手术组进行活性评价。根据进口特立帕肽阳性药临床单次剂量（20 μg/60 kg，人）折算得大鼠的单次给药剂量为1.786 μg /kg，即1.786 ml /kg（1g/ml）。

2.2 双侧卵巢摘除致骨质疏松模型建立[4]

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.32ml/100g），进行双侧卵巢摘除手术，然后逐层缝合、消毒，做好术后护理。手术两周后，对各个实验组大鼠进行皮下给药1.786 μl /kg，其中假手术组和模型组给予相应的生理盐水。

2.3生物样本处理[5]

持续给药16周后，处死大鼠取其胫骨和股骨并检测相关的指标，主要有各组胫骨密度值（bone mineral density，BMD）比较、各组骨力学比较以及血液中ALP活力、钙磷含量变化。具体方法为：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔后进行下腔静脉取血，静置1～2小时后4℃离心（3000rpm/min，15min）得血清，考察ALP、钙磷含量变化；分离出大鼠左右胫骨和股骨并用浸泡过生理盐水的纱布各自包裹，置于-40℃冰箱中保存，待检测。

3 活性评价

3.1胫骨BMD比较

骨密度仪可给出测定对象的骨密度值（bone mineral density，BMD），常以g/cm 表示，基本含义是将当前骨矿物质（BMC）的数量除以被矿物质占据的骨投影区域（区域）的面积。卵巢摘除致骨质疏松症大鼠经过6周给药后，考察其各组胫骨密度值（bone mineral density，BMD）变化。

结果表明，手术组骨质疏松的大鼠胫骨密度BMD为 0.1495±0.0061 g/cm2，与假手术组相比有显著性差异。给予不同批次受试药特立帕肽后BMD均得到显著性改善，与手术组相比具有统计学差异。结果详见表1。

4 讨论

特立帕肽为重组人甲状旁腺激素（rhPTH ）1-34，与内源性PTH类似，可与特异性高亲和性细胞表面受体结合发挥生物学作用[6]。动物实验表明，本品一日1次给药对成骨细胞的刺激作用高于其对破骨细胞的作用，可引起小梁骨和皮质骨表面的新骨生成。

为确认自行制备的注射用特立帕肽体内生物活性，特选择去卵巢大鼠检测其对动物骨质量和生物力学性能的影响。去卵巢大鼠是研究骨质疏松的发病机制和观察药物疗效的经典动物模型，雌性大鼠卵巢切除后，松质骨的骨转换加快，骨量减少，骨强度下降，这种特点类似于人骨质疏松症的骨丢失状态[7，8]。本研究发现，给予去卵巢大鼠皮下注射不同批次生产的注射用特立帕肽16周后，其胫骨BMD及生物力学强度的各项指标较手术组明显升高，与假手术组相近。

碱性磷酸酶（ALP）是参与骨代谢的重要蛋白，与血浆中的钙磷水平一样，都是反应成骨细胞活性的主要指标[9，10]。因此，测定血中钙磷物质的含量及ALP活性水平对于了解骨代谢情况具有重要价值。本实验结果显示，去卵巢16周后，手术组大鼠血中钙磷水平明显下降，血清ALP活性水平上升，说明OVX大鼠处于负钙平衡，体内钙磷流式增加，吸收降低。本实验还观察到，手术模型组反应骨吸收生化指标的ALP活性大大高于假手術组，说明OVX大鼠骨吸收异常增强。皮下注射不同批次待测药物注射用特立帕肽或阳性对照药16周后，可明显抑制血清钙磷水平的下降，同时部分逆转ALP的升高。

以上结果表明，注射用特立帕肽皮下注射可以拮抗上述骨质疏松发生的病理过程，发挥抗骨质疏松作用。该研究进一步验证了固相合成的小分子多肽特立帕肽与国外重组工艺制备的特立帕肽注射液具有一致的体内抗骨质疏松生物活性。

参考文献：

[1] 宋庆明，盛正妍，刘皋林. 特立帕肽治疗骨质疏松症的应用进展[J]. 国际药学研究杂志， 2008， 35（6）： 415-418

[2] Tashjian AH， Jr.， Gagel RF. Teriparatide [human PTH（1-34）]： 2.5 years of experience on the use and safety of the drug for the treatment of osteoporosis[J]. J Bone Miner Res， 2006， 21（3）： 354-365

[3] 药审中心. 2007. 合成多肽药物药学研究技术指导原则. ed.

[4] 徐叔云. 药理实验方法学[M]. 北京： 人民卫生出版社. 2006.

[5] 陈奇. 中药药理实验方法学[M]. 北京： 人民卫生出版社. 1993.

[6] Quattrocchi E， Kourlas H. Teriparatide： a review[J]. Clin Ther， 2004， 26（6）： 841-854

[7] 张铁军，张伟，边立功. 白藜芦醇对去卵巢大鼠骨质疏松症的保护作用[J]. 解剖学报， 2012， 43（5）： 679-684

[8] Yang W， Gao HY， Wang ZG， Jin YC. [Influence of bovine parathyroid hormone-（1-34） on the contraction of the rat vas deferens and the effect of calcium][J]. Zhongguo Yao Li Xue Bao， 1985， 6（1）： 51-55

[9] Yamamoto S， Morimoto I， Yanagihara N， Zeki K， Fujihira T， Izumi F， Yamashita H， Eto S. Parathyroid hormone-related peptide-（1-34） [PTHrP-（1-34）] induces vasopressin release from the rat supraoptic nucleus in vitro through a novel receptor distinct from a type I or type II PTH/PTHrP receptor[J]. Endocrinology， 1997， 138（5）： 2066-2072

[10] Soen S. [Efficacy of teriparatide in treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis][J]. Clin Calcium， 2012， 22（3）： 315-320