莫诺苷对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型黑素合成的影响

于洪敏　陈景华

[摘要]目的：探讨莫诺苷对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型黑素合成的影响。方法：将黑素瘤细胞（A375）与角质形成细胞（Hacat）以1：2比例建立共培养模型，以不同浓度莫诺苷进行干预，通过MTT法测定细胞增殖率；NaOH裂解法测定黑素含量；多巴氧化法测定酪氨酸酶活性。结果：与阴性对照组相比，10-4 mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫诺苷均对细胞增殖无影响（P>0.05），10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫诺苷均对共培养体系酪氨酸酶活性和黑素合成有极显著差异（P<0.01）；与阳性对照药熊果苷组相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫诺苷均对共培养体系酪氨酸酶活性和黑素合成有差异（P<0.05或P<0.01）。结论： 莫诺苷可能通过抑制酪氨酸酶活性来抑制共培养模型的黑素合成。

[关键词]莫诺苷；黄褐斑；酪氨酸酶；黑素

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）08-0833-03

黄褐斑是一种获得性色素沉着性皮肤病，给患者生理和心理都带来很大影响。人体皮肤颜色各不相同，与种族、年龄、性别、外界环境以及某些疾病等因素密切相关，其中黑素细胞产生的黑素是决定皮肤颜色的主要因素[1]，酪氨酸酶是黑素生物合成途径中的主要限速酶，该酶活性大小决定着黑素形成的数量。有研究表明，中药山茱萸的水提取物对黑素合成和黑素合成关键酶酪氨酸酶有抑制作用，提示可能对黄褐斑等色素性疾病具有一定的应用开发前景[2] 。山茱萸是中医治疗黄褐斑方剂中常被采用的中药，中医认为山茱萸通过补肾的功效来治疗黄褐斑[3]。莫诺苷是山茱萸的主要有效成分之一，本实验研究莫诺苷对共培养模型黑素合成的影响及机制。

1 实验材料

莫诺苷（购于上海融禾医药科技有限公司）；人黑素瘤细胞株（A375）（由中国科学院细胞中心提供）；人永生化角质形成细胞（Hacat）（购自武汉大学中国典型培养物保藏中心）；MEM培养基（购于Gibco公司）；胰蛋白酶、双抗、胎牛血清（购于Billab公司）；二甲基亚砜、L-dopa、TritonX-100、熊果苷、甲基噻唑四唑（购于Sigma公司）。酶标仪（上海热电仪器有限公司）；OLympus倒置显微镜（日本Olympus株式会社）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；超低温冰箱（Thermo Electron Corporation）；CO2孵育箱（上海智成分析仪器制造有限公司）。

2 实验方法

2.1 建立共培養模型：待两瓶细胞均生长至对数期时，每个培养瓶中加入1mL25%的胰蛋白酶进行消化，然后分别加入MEM中止消化，1500rpm，离心3min。离心后将细胞重悬。计数板计数。按A375细胞数与Hacat细胞数比例为1∶2将两种细胞悬液混合，接种到需要规格的培养板中。

2.2 细胞增殖率：将 A375 和 Hacat 以1∶2的比例制成细胞悬液，调整细胞密度为 1.5×104个/mL，接种在 96 孔板中，200μl/孔。37℃、5% CO2培养箱中培养24h，弃培养液，阴性组只加含细胞的培养液，阳性组加入3.67×10-3mol/L熊果苷，实验组加入莫诺苷各浓度含药培养液，每孔 200μl，每组设5个复孔，继续培养48 h，在结束前4 h，每孔加20μl 5g/L MTT，继续培养4h，弃原培养液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min，酶标仪在490nm处测吸光度（A），计算细胞增殖率。细胞增殖率=（A实验组/A阴性对照组）× 100%。

2.3 黑素含量：本实验黑素含量测定采用Hunt[4]法。将A375和Hacat以1：2的比例接种到六孔板中，细胞浓度为4.5×104个/ml， 每孔2ml，5%CO2，37℃培养箱中培养24h之后弃原培养液，阴性对照组加培养液2ml，阳性对照组3.67×10-3mol/L熊果苷2ml/孔，给药组设3个复孔，每孔2ml，分别加入含不同浓度莫诺苷的培养液。5%CO2，37℃培养箱中培养48h。48h以后，弃原培养液，用PH7.4的0.01MPBS洗涤2次，然后加入0.25%胰酶1ml/孔消化大约10min后，加入1mlMEM培养液终止消化，制成细胞悬液，将不同组细胞悬液分别收集到15ml离心管中，1500rpm，离心3min，弃上清，加入100μl浓度为1mol/L NaOH，37℃水浴1h。加400μl双蒸水释稀，混匀，每只离心管中取100μl分别加入96孔板中，490nm测定各孔A值。黑素含量=[（A实验组/细胞数的平均值）/（A阴性对照组/细胞数的平均值）]×100%。

2.4 酪氨酸酶活性：细胞内酪氨酸酶活性测定[5]采用多巴氧化法。将A375和Hacat以1：2的比例接种到96孔板中，将细胞浓度调整至1.5×104个/ml， 每孔200μl，5%CO2，37℃培养24h后弃原培养液，阴性对照组只加培养液200μl，阳性对照组加3.67×10-3mol/L熊果苷200μl，给药组加入含不同浓度莫诺苷的培养液，每组设5个复孔，继续培养48h， 用pH7.4的0.01M的PBS洗涤2次，每孔加1%Triton-X溶液100μl，迅速置-80℃冰箱30min，然后室温下融化，充分裂解细胞。37℃预热，加0.2%L-dopa溶液50μl/孔，37℃下反应3h，490nm波长测定A值。

2.5 统计学处理：使用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，所测数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，方差齐性用t检验，多组间比较采用 LSD 检验。

3 结果

3.1 莫诺苷对共培养模型细胞增殖的影响：结果见表1，与阴性组相比，10-4mol/L与10-7mol/L之间莫诺苷对共培养模型的抑制率在10%以下，适合进行下一步研究。

3.2 莫诺苷对共培养模型酪氨酸酶活性的影响：结果见表2，与阴性对照组相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L对共培养模型酪氨酸酶活性的抑制作用有显著差异（P<0.01）。与阳性对照药熊果苷组相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L对共培养模型酪氨酸的抑制作用有差异（P<0.05），抑制作用强于熊果苷。

3.3 莫諾苷对共培养模型黑素合成的影响：结果见表3，与阴性对照组相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L对共培养模型黑素合成的抑制作用有显著差异（P<0.01）。与阳性对照药熊果苷组相比，10-5mol/L和10-6mol/L对共培养模型黑素合成的抑制作用有差异（P<0.05），10-7mol/L有显著差异（P<0.01），抑制作用均强于熊果苷。

4 讨论

黄褐斑病程较长，发展缓慢，以中青年女性多见，严重影响美观，现已成为医学和美容界共同面临的难题 [6]。黄褐斑的发病原因，已经实验证明的一点是由于黑色素增多形成的[7]。皮肤色素或黄褐斑与酪氨酸酶有密切关系。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸转化为黑色素，从而加重皮肤色斑的形成[8]。黑素生成量与TYR活性相关，控制其活力即可控制黑素生成量[9]。黑素在表皮基底部的黑素细胞中形成。其过程为黑素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌最终形成黑素[10]。通过黑素细胞（MC）的体外纯培养可以研究黄褐斑、白癜风、白发等色素障碍性疾病的发病机制，也可以利用黑素细胞模型来筛选治疗这些疾病的药物和方法[11]。黑素细胞与邻近细胞间的相互作用不容忽视，故黑素细胞和角质形成细胞共培养提供了一种更好的检测模型[12]。实验表明莫诺苷对A375和Hacat共培养模型酪氨酸酶活性和黑素合成均有抑制作用，对共培养细胞增殖率无明显影响，表明莫诺苷在不杀细胞浓度范围内通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑素合成，而且抑制作用强于阳性对照药熊果苷。莫诺苷的研究结果与预想一致，这对于开发治疗黄褐斑的药品或者化妆品有较大的应用前景。

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[收稿日期]2013-04-08 [修回日期]2013-04-18

编辑/张惠娟