循环microRNAs与局灶节段性肾小球硬化患者疾病活动的关系

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)是一个病理形态学诊断名词，其发病机制尚未完全明确，尤其是循环因子在FSGS发病中的研究结果更是莫衷一是。循环因子在FSGS发病中的作用很早就为人们所关注，有研究发现，FSGS患者在肾移植术后原发病可很快复发[1]，但复发FSGS即行血浆置换可有效减少蛋白尿[2，3]，FSGS复发患者的血浆注射大鼠后可诱发蛋白尿[4-6]。离体功能实验证实FSGS患者血浆可增加肾小球对白蛋白的通透性[4-6]。陈朝红等[7]的研究也发现，部分FSGS患者血清可诱导足细胞骨架损伤、破坏足细胞间紧密连接，并可导致大鼠产生蛋白尿。尽管人们在不停的探寻循环因子，但其本质仍不清楚。

研究发现，组织或细胞来源的microRNAs(miRNAs)可在血清、血浆等体液中稳定存在，不仅如此，循环miRNA可随血循环到达远隔器官和组织，继而影响其功能，是一种新的细胞-细胞之间相互作用的方式[8，9]。Zhang等[8]认为组织或细胞来源的miRNA可包裹在分泌性微囊泡(MV)中，随着MV分泌到循环中，进入靶细胞作为内源性miRANs调节多种靶基因或者信号事件。如Mittelbrunn等[10]研究发现免疫细胞间存在抗原依赖的exosome介导的单向的miRNAs转移，这种miRNAs的转移可加强免疫细胞间的信号传递，调节免疫反应中基因的表达。又如Cantaluppi等[11]发现内皮祖细胞来源的MV能通过miRNA依赖的肾脏细胞的重编程保护肾脏免于缺血再灌注损伤。

循环miRNAs能否作为一种循环因子参与FSGS的发病呢?本研究通过TaqMan低密度芯片及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术，寻找出与FSGS活动相关的循环miRNAs，为下一步揭示循环因子本质奠定基础。

对象和方法

病例选择入选标准：性别不限，年龄18～60岁，肾活检明确诊断为特发性FSGS。采样时患者临床表现为活动[即尿蛋白定量≥3.5 g/24h，血清白蛋白(Alb)≤30 g/L]或非活动(即尿蛋白定量<0.4 g/24h，Alb>35 g/L)。排除标准：继发性FSGS、合并恶性肿瘤、糖尿病、难以控制的高血压、近半年内出现心肌梗塞、心力衰竭、脑出血等严重心脑血管并发症、既往1月内出现感染者(如肺部感染，局部软组织炎，反复上呼吸道感染)、谷丙转氨酶或谷草转氨酶>正常值的2倍、明确的乙型肝炎或其他病毒感染血清学指标阳性者、妊娠、哺乳期女性。同时选取年龄、性别匹配的正常志愿者作为正常对照。所有患者均签署书面知情同意书。

临床资料收集所有入组患者，收集记录以下临床数据：年龄、性别、24h尿蛋白定量、Alb、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)和总胆固醇。

血浆标本的留取对所有入选者，使用EDTA抗凝管留取血液标本，室温静置1h后，于室温3 000g离心10 min，将上清转移入除酶的Eppendoff管后于4℃10 000g离心5 min，将上层血浆转移入新的除酶的Eppendoff管中-80℃保存备用。

血浆总RNA提取对于送检TaqMan低密度芯片的标本，选取性别、年龄匹配的活动性FSGS患者及正常对照各9例，每组每例取等量血浆混合后使用Trizol(Invitrogen)法提取总RNA，即每份血浆中加入两倍体积的Trizol，然后进行2次酚/氯仿抽提，得到的RNA用20 μl DEPC水溶解后送Invitrogen公司行miRNA低密度芯片检测[12]。对于进行qRT-PCR验证的标本，每例取100 μl血浆，用酚/氯仿去除蛋白，异丙醇沉淀RNA，20 μl DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用[13]。

血浆miRNA低密度芯片检测将提取的血浆总RNA送Invitrogen公司行TaqMan低密度芯片检测。芯片版本为TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0，采用7900HT PCR 系统进行检测(Applied biosystems)。通过分析扩增曲线，得到所检测miRNAs的循环阈值(threshold cycle，CT)，以U6为内参，2-ΔΔCT计算各miRNAs的变化倍数，选取CT值<30且活动性FSGS循环miRNAs较正常对照升高>2倍的miRNAs进行后续的验证。

差异表达miRNAs的验证差异表达miRNAs的验证采用qRT-PCR方法。10 μl逆转录体系包括：5×逆转录缓冲液(Takara)2 μl，AMV逆转录酶(Takara)0.5 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)1 μl，茎环逆转录引物(Applied Biosystems)1 μl，RNA 2 μl，DEPC水3.5 μl。反应条件为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。所得到的cDNA于-20℃保存备用。20 μl定量PCR体系包括：10×PCR缓冲液(Takara)2 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)0.4 μl，MgCl2(Takara，25 mmol/L)1.2 μl，Taq酶(Takara)0.3 μl，TaqMan探针(Applied Biosystems)0.33 μl，水14.77 μl，cDNA 1 μl。反应条件为：95℃ 5 min，然后95℃ 15s，60℃ 1 min进行40个循环。所有的PCR反应均行3副孔。

统计学分析利用统计软件SPSS 18.0对相关数据进行统计学分析。以miRNA-16绘制标准曲线，计算每例标本中miRNA的绝对表达量(fmol/L)。采用Mann-Whitney U检验比较不同组之间循环miRNAs表达水平的差异。采用受试者操作特性曲线(ROC curve)及ROC曲线下面积(AUC)评估循环miRNAs区分活动性FSGS与非活动性FSGS及正常对照的价值。采用Spearman相关性分析分析循环miRNAs表达量与各临床指标间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

临床资料本研究选取9例活动性FSGS用于TaqMan低密度芯片分析。其中男性6例，女性3例，平均28.44岁。9例正常对照的年龄、性别与活动性FSGS患者匹配。后续qRT-PCR验证选取活动性FSGS患者32例，年龄、性别匹配的正常对照30例。同时我们还检测了15例非活动性FSGS患者血浆中候选miRNAs的水平，三组基本临床资料见表1。

表1 循环miRNAs水平验证病例的临床资料

FSGS患者循环miRNAs低密度芯片检测结果及差异miRNAs筛选该芯片总共检测754个miRNAs，本研究中共检出242个miRNAs，检出率为32%。另有68%的miRNAs由于在血浆中含量较低，未能检出，表明现有芯片的检测灵敏度对于一些丰度较低的miRNAs的筛选有待提高。以miRNAs变化倍数>2倍且CT值<30作为筛选条件，在活动性FSGS患者血浆中上调的miRNAs有45个，下调的miRNAs有119个。选取上调的miRNAs进行独立样本验证。

FSGS患者循环中表达上调的miRNAs的独立样本验证为了验证TaqMan低密度芯片结果，我们采用qRT-PCR的方法在独立样本中对活动性FSGS患者循环中表达上调的miRNAs进行了验证。表达上调的miRNAs定义为：CT值<30、上升倍数>2倍、两组比较P<0.05。独立样本包括32例活动性FSGS和30例正常对照。两组的年龄、性别无差异，与正常对照组相比，活动性FSGS循环miRNA-125b、miRNA-186及miRNA-193a-3p表达上调(表2，图1)。为了寻找与FSGS活动性相关的miRNAs，我们进一步检测了非活动性FSGS患者循环中这3种miRNAs的水平。结果显示，与正常对照相比，非活动性FSGS患者循环中仅miRNA-125b和miRNA-193a-3p升高，而miRNA-186无明显变化(表2，图1)。与非活动性FSGS相比，活动性FSGS患者循环miRNA-186表达则明显上调(表2，图1)。

表2 循环中表达上调miRNAs含量的比较

图1 三组患者循环miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p浓度

循环miRNAs含量与临床指标的相关性分析活动性FSGS患者循环中上述3种miRNAs的表达量较正常对照明显升高，我们进一步探讨了循环中这3种miRNAs的浓度与临床指标之间的相关性，仅发现循环miRNA-125b水平与BUN水平显著正相关(相关系数为0.406，P=0.021)。循环中上述3种miRNAs水平，与患者年龄、性别、尿蛋白定量、Alb、SCr、总胆固醇水平均无相关性。

循环miRNAs水平与FSGS疾病活动的关系我们采用ROC曲线分析了循环miRNAs区分活动性FSGS与正常对照的能力。结果显示上述3种miRNAs对于区分活动性FSGS与正常对照均具有较高价值,AUC分别为0.882(95%CI：0.802～0.963)、0.789(95%CI：0.674～0.903)和0.910(95%CI：0.84～0.981)。以5.706 fmol/L为界值时，miRNA-125b的最优敏感度和特异度分别为81.3%和80%；以38.352 fmol/L为界值时，miRNA-186的最优敏感度和特异度分别为62.5%和90%；以8.011 fmol/L为界值时，miRNA-193a-3p的最优敏感度和特异度分别为78.1%和93.3%(图2A～C)。这三者中miRNA-193a-3p具有最高的特异度，而miRNA-125b具有最好的敏感度。

通过qRT-PCR验证后发现，循环miRNA-186水平在活动性FSGS和非活动性FSGS患者间存在显著差异，于是我们采用ROC曲线分析了循环miRNA-186对FSGS疾病活动判断的价值(图2D)。结果显示循环miRNA-186对FSGS活动与否具有较高的判断价值，AUC为0.848(95%CI：0.736～0.960)。以31.16fmol/L为界值时，miRNA-186区分FSGS活动与非活动的最优敏感度和特异度分别为75%和93.3%。

图2 A～C：FSGS-A组循环miRNAs与正常对照组ROC曲线的比较；D：FSGS-A组与FSGS-NA组ROC曲线的比较

讨 论

目前，FSGS的发病机制尚未完全阐明。临床实践发现FSGS患者肾移植术后数小时或数天内原发病即可复发[1]，复发的FSGS进行血浆置换或免疫吸附可有效减少蛋白尿[2，3，14]。患有FSGS的母亲娩出的新生儿可出现短暂的蛋白尿[15]。研究发现部分FSGS患者血浆不仅可以增加肾小球对白蛋白的通透性，而且注射大鼠后可诱发蛋白尿[4-6]。陈朝红等[7]也发现部分FSGS患者血清可导致足细胞骨架蛋白F-actin和足细胞间紧密连接蛋白ZO-1的破坏，而这部分阳性血清注射大鼠可导致大鼠足细胞足突融合和蛋白尿的产生。这些重要的临床现象及研究结果均提示FSGS患者蛋白尿的发生与循环因子有关，为人们研究循环因子在FSGS发病中的作用提供了依据。

自从1972年Hoyer等[1]学者首次提出循环因子概念，大量研究提示特发性FSGS中可能有循环因子的存在。研究认为循环因子为30～50 kD的糖蛋白，包含疏水基团，对蛋白A、半乳糖具有高亲和性，在70%～80%饱和硫酸铵溶液中具有最高的活性，对热及蛋白酶敏感，可被血浆置换清除[4，6，16]。有研究认为心肌营养素样因子(CLC-1)可能作为一种循环因子引起肾脏损伤[17]。CLC-1是白细胞介素6(IL-6)家族成员，分子量约30 kD，可经半乳糖亲和层析法富集，存在于活动性FSGS患者血浆中，能引起Palb增加，降低肾小球中nephrin的表达，而CLC-1抗体则可以阻断FSGS患者血清引起Palb的增加。Wei等[18]等则在复发性FSGS患者血浆中检出可溶性尿激酶受体(suPAR)，他们发现复发性FSGS患者移植前血浆中suPAR升高。suPAR通过活化足细胞整合素β3引起足突融合及蛋白尿。但是糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病时suPAR也是升高的[19，20]，suPAR与循环因子的关系及suPAR的来源目前都不清楚。尽管人们在不停的探寻循环因子，但其本质及作用机制仍不清楚。

近年研究认为循环miRNAs是一种新的细胞-细胞之间交流的方式。如EB病毒感染的细胞分泌的含有病毒miRNAs的exosome能进入未感染的受体细胞，抑制CXCL11的表达[21]。在免疫细胞之间，同样存在着这种交流方式，如Mittelbrunn等[10]研究发现T细胞分泌的miRNAs(如miRNA-335)可以在exosome的介导下单向转移到抗原递呈细胞(APC)中，并显著下调APC中其靶基因SOX4的表达。这种miRNAs的转移可加强免疫细胞间的信号传递，调节免疫反应中基因的表达。还有研究发现单核巨噬细胞(THP-1)分泌的miRNA-150能以MV的形式进入人微血管内皮细胞株(HMEC-1)细胞，使后者miRNA-150表达水平明显升高，c-Myb蛋白的表达明显下降，从而增强HMEC-1细胞的迁移能力，体内研究则发现THP-1分泌的miRNA-150能进入血管内皮细胞，增加血管内皮细胞中miRNA-150的表达水平[8]。间充质干细胞分泌的MVs能促进肾小管上皮细胞的增生，使其免于凋亡，并且能促进丙三醇诱导的SCID小鼠急性肾损伤(AKI)的形态和功能恢复[22]。这些结果表明病理状态下MV中携带的分泌性miRNAs可到达受体细胞和远隔组织发挥功能。

基于以上几点，我们试图探讨FSGS患者T细胞分泌的循环miRNAs能否作为一种循环因子，引起足细胞损伤及蛋白尿。而本研究则通过TaqMan低密度芯片及qRT-PCR方法系统分析了FSGS患者循环miRNAs表达谱，寻找出与FSGS活动性相关的循环miRNAs，为探讨这一问题奠定了基础。本研究发现活动性FSGS患者循环miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p含量较正常对照明显升高，表明这3种miRNAs表达水平可能与活动性FSGS相关。ROC曲线分析表明循环miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p均能较好的区分活动性FSGS与正常对照。但由于样本量较小，我们并未发现这些miRNAs含量与尿蛋白、Alb等临床指标之间的相关性。为了进一步探讨这3种循环miRNAs与FSGS活动性的关系，我们检测了非活动性FSGS患者循环中这3种miRNAs的表达情况。我们发现与非活动性FSGS相比，活动性FSGS患者循环miRNA-186水平显著升高，而miRNA-125b和miRNA-193a-3p水平则无明显变化。而ROC曲线分析也显示循环miRNA-186能较好的区分活动性FSGS与非活动性FSGS。这些结果表明循环miRNA-186水平与FSGS活动性关系更为密切。

研究发现miRNA-125b参与调节核因子κB(NF-κB)通路从而控制多种器官的分化[23]；慢性肾脏病(CKD)3～4期的患者，血清miRNA-125b、miRNA-145和miRNA-155表达下调，CKD大鼠胸主动脉及原代血管平滑肌细胞中miRNA-125b的表达也是下调的，在CKD患者血管重塑异常中可能发挥了一定作用[24]。 miRNA-186的作用广泛，在多种疾病中都被发现表达异常，在不同疾病中其作用也不一样。急性心肌梗死患者血清miRNA-186水平较正常对照显著升高，与其他五种升高的miRNAs(miRNA-1、miRNA-134、miRNA-208、miRNA-223和miRNA-499)一起，可作为诊断急性心肌梗死的生物标志物[25]。在非小细胞肺癌(NSCLC)中miRNA-186通过抑制PTTG1的表达而抑制NSCLC的转移[26]，而沉默miRNA-186后促进NSCLC细胞的增生，在NSCLC组织中miRNA-186的表达下调，且miRNA-186表达低与患者生存率低相关[27]。而在子宫内膜癌细胞中，miRNA-186可通过抑制抑癌基因FOXO1的表达而使细胞周期调节异常、细胞凋亡异常[28]。miRNA-193a-3p通过抑制其靶基因Mcl-1，诱导U251和HeLa细胞的凋亡、ROS堆积及DNA损伤[29]。结直肠癌患者癌组织及血中miRNA-193a-3p、miRNA-23a和miRNA-338-5p表达上调，且其表达水平随肿瘤进展而升高，可能作为结直肠癌早期诊断的标志物[30]。但是，miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p在FSGS中的作用尚不清楚，今后我们会在本研究的基础上深入探讨这一问题。

小结：本研究发现活动性FSGS患者循环miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p表达高于正常对照，且活动性FSGS患者循环miRNA-186高于非活动性FSGS患者，表明循环miRNAs与FSGS患者活动性密切相关。本文结果提示循环miRNAs不仅可能作为判断FSGS疾病活动的生物标志物，且可能在FSGS发病中起到重要作用。

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