夏枯草色素的抗氧化活性研究

宋海璐，周琼花，严婷婷，黎入荧，黄锁义

(1.右江民族医学院 临床学院，广西 百色533000;2.右江民族医学院 药学系，广西 百色533000)

夏枯草(Prunella vugaris L.)为唇形科夏枯草属植物，具有清肝明目、清热利尿、软坚散结等功效，常用于治疗肝火郁结、目赤肿痛、肝阳上亢、累疬结核等症。现代研究发现，夏枯草含有三萜、甾醇、黄酮、有机酸、多糖等多种化学成分，具有抗菌、抗病毒、抗高血压、免疫调节等多种药理活性［1］。

近年来，人们对生活的要求越来越高，安全意识日益增高。目前研究结果表明许多植物和微生物的色素均具有生理活性，其药用价值逐渐被人们认识和开发，而且为生产各种食用品、化妆品、医用药品等色素产品提供了丰富的原料。天然色素已经成为当今人们崇尚自然，崇尚安全的世界食品发展潮流的必然产物［2］，作为一种天然的食品添加剂，它不仅赋予食品色泽，给人以美的享受，对增加食欲有重要的作用，同时还是鉴别和评价食品质量的基础［3］。近年来，夏枯草色素的抗氧化性尚未见报道，为此，本文以蒸馏水作为提取剂，研究夏枯草色素对DPPH·、O-2·和·OH 自由基的清除作用以及还原Fe3+能力。

1 仪器与材料

722N 可见分光光度计(上海精科);电子称(上海民桥精密科仪器有限公司);HH-SA 数显恒温水浴锅(上海上登实验设备有限公司);DPPH (美国Signa 公司)。夏枯草购自广西百色市。

2 方法与结果

2.1 夏枯草色素的提取

取烘干的夏枯草，粉碎至粉末，称取夏枯草粉末约5 g。选取蒸馏水为提取剂，室温下浸泡24 h，过滤，去渣［4］，滤液经水浴锅蒸发得到浓缩膏待用［5］。

2.2 色素提取物清除DPPH 自由基能力

DPPH 是一种稳定的自由基，与抗氧化剂发生反应，提供H 被还原，颜色发生变化，由深紫色变为淡黄色，可以用紫外可见分光度法定量测定。取0.5 mL 新配置的DPPH 溶液［c(DPPH)=6 ×10-4mol/L］置于10 mL 的具塞比色管中，然后加入不同体积的样品溶液，无水乙醇定容至5 mL，室温暗光下反应30 min，以无水乙醇调零，在517 nm 处测定其吸光度A。以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品对自由基的清除率，以自由基清除率为50%时样品的浓度(IC50)来衡量样品对自由基的清除能力。IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强。其清除率计算公式:

其中A1为反应时间t=0 min 时空白吸光度，A2为反应时间t=30 min 时的吸光度。

以实验色素提取液作为样品用无水乙醇定容至5 mL 分别测其对DPPH 自由基清除的作用，由图1可以看出，随着色素浓度的增加，对DPPH 的清除作用增大，自由基清除率为50%时样品的浓度(IC50)为0. 19 mg/mL，浓度较小，表明夏枯草色素清除DPPH 自由基的能力较显著。

图1 DPPH 自由基清除率

2.3 色素提取物清除超氧自由基能力

采用邻苯三酚自氧化法进行测定。具体方法如下:取0.5 mol/L、pH8.2 的Tris - HCl 缓冲液4.0 mL 于干燥具塞比色管中，置于25 ℃水浴中预热20 min，分别加入不同浓度的待测品0.2 mL，后均加入2.5 mmol/L 邻苯三酚(由10 mmol/L HCl 制)0.8 mL，混匀后25 ℃水浴中准确反应4 min，立即加入10 mmol/L HCl 2 滴终止反应，蒸馏水调零，在320 nm 处测定吸光度A。其清除率计算公式:

其中A0:为加邻苯三酚但不加样品时的吸光度;A1:为加样品和邻苯三酚时的吸光度;A2:为加样品不加邻苯三酚时的吸光度。

从图2 中可以看出，夏枯草色素提取液对O-2·有一定的清除作用，随着夏枯草色素提取液浓度的增加，对O-2·自由基的清除能力也增强，说明当色素的浓度增加时，其清除率也增大。

图2 超氧自由基清除率

2.4 色素提取物清除·OH 自由基能力

参照Fenton 反应的方法建立反应体系模型［6］，利用H2O2与Fe2+反应产生·OH，由于·OH 具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地与·OH 结合，产生有色产物。反应是如下:H2O2+Fe2+→Fe3++·OH+OH-

该产物在510 nm 处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH 功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色参物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8. 8 mmol/L H2O21 mL，9 mmol/L Fe2+1 mL，9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1 mL)加入一系列不同浓度的样品溶液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液为比较，在510 nm 处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物(色素)对·OH 的清除作用，其清除率计算公式:

清除率(%)=［(A0-AX)/A0］×100%

本实验以色素提取液作为样品，分别取不同体积的样品定容到10 mL 分别测其对·OH 的清除作用。从图3 中可看出，随着色素浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强。

图3 ·OH 自由基清除率

2.5 还原Fe3+能力

采用普鲁士兰法测定样品还原Fe3+能力。在系列10 mL 具塞比色管中依次加入不同浓度的样品溶液2.5 mL，2.5 mL 磷酸盐缓冲液［c(磷酸盐缓冲液)= 0. 2 mol/L pH6. 6］和2. 5 mL 铁氰化钾(1%)，混匀后置于50 ℃水浴中反应20 min，然后加入2.5 mL 三氯乙酸(10%)，混匀后将溶液浑浊离心(3 000 r/min)10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL(0.1%)三氯化铁溶液，混匀，以试剂空白作参比，在700 nm 处测定吸光度值，吸光度值增加表明还原能力增强。

由表1 可以看出，随着色素浓度增大，其吸光度值增加，对Fe3+还原能力增强。

表1 还原Fe3+能力吸光度值

3 结 论

本实验表明，夏枯草色素对DPPH·、O-2·和·OH三种均具有较好的清除作用，而且对自由基的清除作用随着色素液浓度的增加而增强。当色素的浓度为3.5 mg/mL 时，其清除率O-2·为4.1%、DPPH·为28.3%、·OH 为17.9%，如图4 所示。对自由基的清除能力总体强弱是:DPPH·＞·OH ＞O-2·;对金属Fe3+还原能力随色素的浓度增加而增强。因此，夏枯草色素具有较强的抗氧化活性。

近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点备受青睐，而色素的天然作用引人瞩目。我国拥有丰富的夏枯草资源，夏枯草色素所具有的抗氧化活性使其有望作为天然抗氧化剂和功能性产品而得到开发利用，是潜在的天然着色剂和理想色素来源，因此，具有良好的开发价值和利用前景。同时，为今后对色素的结构修饰和合成、发现先导化合物提供理论依据和重要的参考意义，这必将对新药的产生、新抗氧化剂的开发、应用及研究产生较大的影响。

图4 对DPPH·、O -2·和·OH 三种自由基清除率的比较

［1］ 席与斌，吴允孚，陈刚.夏枯草多糖的分离及抗氧化活性研究［J］.广东药学院学报，2010，26(6):595 -598.

［2］ 杨合超. 诚谈天然食用色素的开发［J］. 农产品开发，2007，(4):48 -49.

［3］ 曾柏全，邓子牛，李凯霞，等.藤捻葡萄的色素提取及稳定性研究［J］.食品科技，2008，33(3):160 -162.

［4］ 谢燕飞，梁绍兰，黄锁义，等.广西茉莉花叶色素的提取及其理化性质研究［J］.检验医学教育，2011，18(2):45 -47.

［5］ 李楠. 黑花生抗氧化性研究［J］. 食品开发与研究，2012，33(3):107 -109.

［6］ 高昌勇. 迎春花色素提取及抗氧化性研究［J］. 生物技术，2010，20(1):50 -60.