阿霉素诱导的心力衰竭小鼠心脏去甲肾上腺素转运蛋白的表达变化*

靳文英， 乔正国， 郑春华 ，李素芳， 陈红

阿霉素诱导的心力衰竭小鼠心脏去甲肾上腺素转运蛋白的表达变化*

靳文英， 乔正国， 郑春华 ，李素芳， 陈红

目的： 观察阿霉素诱导的充血性心力衰竭（心衰）小鼠心脏去甲肾上腺素转运蛋白（NET）的表达变化。

去甲肾上腺素转运蛋白；阿霉素；充血性心力衰竭；交感神经

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:458.)

在心力衰竭（心衰）的发生发展中，交感神经系统的过度激活是加重心功能恶化的重要因素。去甲肾上腺素转运蛋白（NET）位于肾上腺素能神经突触前膜上，属于单胺类 Na+/Cl-依赖性转运蛋白，其功能是将神经元释放的去甲肾上腺素（NE）再摄取回突触前膜内，对调控突触间隙中的NE浓度、终止神经冲动信号、维持受体对神经递质的敏感性极 为 重 要[1,2]。 既 往 研 究 发 现 心 衰 时 存 在 有 心 脏NET 的表 达和功 能异常[3-6]， 其介导 的 NE 再摄取减少，可能在心衰的发生发展中起着重要作用。既往研究多采用主动脉结扎或心室快速起搏的方式来制备心衰动物模型，但手术操作可能损伤心脏附近的交感神经纤维，而手术打击和心室快速起搏均会刺激交感神经系统的兴奋，有可能会影响交感神经系统功能的测定。本研究利用阿霉素诱导的充血性心衰小鼠动物模型，在不影响交感兴奋性的前提下观察心衰早期 NET在心脏的表达变化。

1 材料与方法

慢性充血性心衰小鼠模型的建立：雄性C57BL/6J 小 鼠 共 20 只， 年 龄 3～4 周， 体 重（25.5±2.8）g。分 为对照组和 阿霉 素组各 10 只。参 照 Teraoka 的方 法[7]，阿霉 素组小鼠给予盐酸阿霉素（辉瑞制药有限公司 ）腹腔注射 2 mg/kg，每 3天注射一次共 5次，以后则每 7天注射一次共 6次，累计用量 22 mg/kg；对照组小鼠给予腹腔注射同等量的生理盐水。两组小鼠均正常饮食喂养，第10周末做为实验终点。行超声心动图检查检测小鼠心功能。支配小鼠心脏的交感神经节主要发自颈中—星状神经节复合体（middle cervical-stellate ganglion complex, MC-SGC），而 心 脏交 感 神经 NET mRNA在 MC-SGC 中表达，NET 则通过轴突运送至心脏的交感神经末梢突触前膜上[8]。小鼠过量麻醉处死后，剪开胸腔暴露心脏及主动脉，于颈部中央分离双侧颈动脉旁的颈交感神经干，向下分离至主动脉弓，摘取颈交感神经节，并迅速摘取小鼠心脏，分别置于液氮中速冻，分离的颈交感神经节和心脏标本均冻存于 -70℃待测。分别称量每只小鼠心脏和体重，计算心脏重量与体重之比（HW/BW）。

超声心动图：应用超声心动图仪（飞利浦公司 IE33）及 15 MHz 高频探头，小鼠半量麻醉，保持自主呼吸，于胸骨旁乳头肌水平短轴切面采集左心室二维图像，获得二维引导下 10个心动周期的M型超声心动图记录。测量左心室舒张末期内径（LVDd），收缩末期内径（LVDs）以及室间隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd），计算左心室舒张末期容积（LVEDV），LVEDV=7×LVDd3/ (2.4+LVDd)；左 心 室 收 缩 末 期 容 积（LVESV），LVESV=7×LVDs3/(2.4+LVDs)；并计算左心室射血分数（LVEF，%）=(EDV-ESV)/EDV，左心室短轴缩短率（FS，%）=（LVDd- LVDs）/LVDd；左心室质量 (LV mass) =1.05[(IVS+LVPWd+LVDd)3-LVDd3]。

实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 mRNA 的 表 达：小 鼠NET mRNA 表达于支配心脏的颈交感神经节中，心脏的β1肾上腺素能受体则分布在心脏交感神经末梢内，取冰冻的颈交感神经节（MC-SG 复合体）和心 脏 组 织 匀 浆 后，Trizol法 提 取 组 织 总 RNA， 溶于 无 RNA 酶 水 中。 采 用 东 洋 坊 RT-PCR 试 剂 盒（TOYOBO，大阪，日本）逆转录，逆转录反应获得 cDNA， 实 时 荧 光 定 量 PCR(PCR 分 析 仪：DNA Engine OpticonR，Bio-Rad； 分 析 软 件：Opticon Monitor 3, Bio-Rad)测定 mRNA 含量。NET 引物序列为：上游 5’-GCACCTCCATTCTGTTTGCGGT-3’；下 游 5’-GCTCAACGAACTTCCAACACAGC -3’； 肾 上 腺 素 能 受 体 β1-AR 引 物 序 列：上游 5’-TGTGACGGCCAGCATCG-3’; 下 游5’-GCAGGCTCTGGTAGCGAAA-3’； 内 参 对照 采 用 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)， 引 物 序 列 为上 游 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ ， 下游 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。 反 应条 件 为：预 变 性 94℃ 3min， 变 性 94 ℃ 15 s， 退火 60 ℃ 15 s， 延 伸 72 ℃ 15 s， 共 40 个 循 环。以 GAPDH 作 为 内 参， 计 算 相 对 表 达 量 =2-△Ct，△ Ct=Ct（ 目 的 基 因 ）-Ct（ 内 参 基 因 ）。Ct值 为每个反应管内的荧光信号到达阈值时所经历的循环数。

Western Blot法 测 定 心 肌 蛋 白 的 表 达：取 适量冰冻心肌组织，应用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟 PMSF）提取心肌组织总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司 ）测定蛋白浓度[9]；加入十二烷基磺酸钠（SDS）上样缓冲液，100℃变性；进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；室温封闭 2 h 后，将 PVDF 膜与一抗室温下孵育 1h 并 4℃过夜，然后二抗室温下孵育 1h；超敏化学发光法（ECL）显影， 应 用 Bio-Rad 凝 胶 图 像 成 像 系 统 和 Quality one 软件进行扫描分析。兔抗鼠 NET 抗体购自Alomone 公司（Alomone Labs, 耶路撒冷，以色列 ），兔抗鼠 TH 抗体购自 Abcam 公司（剑桥市，马萨诸塞州，美国）。

免疫组织化学染色：将小鼠心脏用 OCT包埋剂（SAKURA，洛杉矶，美国）包埋，于 -23℃切成 12 μm 厚的冰冻切片。取小鼠左心室冰冻切片，将 切 片 在 预 冷 的 10% 甲 醛 溶 液 中 固 定 10 min，PBS 磷酸盐缓冲液（135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4, pH7.4）冲洗 3 次，滴加血清封闭液封闭 30 min 后，一抗 4℃过夜，常温 复 温 30 min，PBS 冲 洗 3 次；二 抗 37 ℃ 孵 育20 min，PBS 冲洗 3 次后滴加 SABC 溶液 20 min，PBS冲洗 3次，二氨基联苯胺法（DAB）显色，蒸馏水冲洗，脱水，透明，中性树胶封片后显微镜下观察（Leica DM 4000B）。SABC（链霉亲和素—生物素复合物）免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司，Masson 染色试剂盒购自上海江莱生物公司，并按照试剂盒说明书进行染色[10]。

统计学处理：数据以均数±标准差表示，使用SPSS 10.0 统计软件进行统计分析。对两组均数的比较采用两样本的t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

两组小鼠临床及超声结果：两组小鼠分别腹腔注射阿霉素和生理盐水，在实验第 10周末，对照组小鼠生长良好，体重 (27.68±1.96) g，精神状态好。阿霉素组小鼠 10周末死亡 2只，存活的 8 只小鼠体重（23.52±1.62） g，较对照组明显减轻（P＜0.01），差异有统计学意义，且存在精神萎靡的表现，但两组小鼠心脏/体重比值无明显变化。行超声心动图检查测定小鼠左心室收缩末及舒张末内径，并计算心功能指标。阿霉素组小鼠经小剂量多次阿霉素腹腔注射后，与对照组比较心肌运动幅度明显减弱（图1），左心室射血分数、左心室短轴缩短率明显降低，左心室收缩末期内径、左心室舒张末容积、左心室质量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05～0.01，表1），Masson 染色提示阿霉素组小鼠心肌纤维化较对照组增多（图2）。

心衰小鼠心脏 NET的 mRNA 表达：实时荧光定量 PCR 的方法测定小鼠颈交感神经节中 NET 的 mRNA表达量无明显变化。同时我们检测了心脏肾上腺素能受体 β1-AR 的表达，结果显示心衰小鼠心脏 β1-AR 的 mRNA 表达量与对照组比较差异无统计学意义。

阿霉素组心衰小鼠心脏 NET的蛋白表达：采用Western blot方法检测小鼠心脏中 NET 的蛋白表达量。如图3所示，阿霉素组小鼠心脏组织NET的蛋白表达量明显较对照组降低（P＜0.05），并且 NE 合成限速酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的蛋白表达量显著增加（图3，P＜0.05）。进一步用免疫组化方法检测TH染色阳性的交感神经纤维密度，如图4所示，阿霉素组和对照组小鼠心脏交感神经纤维密度没有明显差异。

表1 小鼠超声心动图测量指标（±s）

图1 实验第 10 周末小鼠 M 型超声心动图

图2 小鼠左心室 Masson 染色

图3 小鼠心脏中 NET 和 TH 的蛋白表达

图4 小鼠左心室交感神经纤维密度

3 讨论

在心衰的发生发展中，交感神经系统的过度激活是加重心功能恶化的重要因素。目前一致认为，阻断神经内分泌的过度激活，防治心肌重构是 治 疗 心 衰 的 关键[11,12]。NET 位 于 交 感 神 经 突触前膜上，对神经递质的调控具有重要作用，但其在心衰中的作用尚不清楚。本文研究结果证实在阿霉素诱导的慢性充血性心衰小鼠模型中，在交感神经纤维密度无明显变化的心衰早期，小鼠心脏 NET 的蛋白表达量下调，TH 蛋白表达增加，提示心衰早期时 NET 的表达下调可导致 NE 再摄取减少，心脏 NE蓄积致突触前NE储备耗竭，NE的合成代偿性增加。

既往研究多采用主动脉结扎或心室快速起搏来制备心衰动物模型，但手术操作可能损伤心脏附近的交感神经纤维，而手术打击和心室快速起搏均会刺激交感神经系统的兴奋，有可能会影响交感神经系统功能的测定。阿霉素具有很强的心脏毒性，其累积的毒性可导致中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，最终诱发充血性心衰，在不影响交感活性前提下是较好的研究容量超负荷心衰的动物模型。在我们的阿霉素诱导心衰小鼠模型中，心衰小鼠心脏NET mRNA 水平没有变化，但蛋白表达量下降，表明心衰时 NET 存在转录后的下调。这与既往研究的报道一致：在主动脉缩窄术致充血性心衰的大鼠模型中，心脏 NET mRNA 表达不变，但心脏 NET再摄取功能受损，交感神经末梢 NET 蛋白表达和活性降低[13]。心衰 时 NET 存 在转录后蛋 白表达 的调控，这个调控可以是量的变化，也可以是细胞内靶向定位的改变。mRNA 代表基因转录水平，蛋白代表翻译水平，表示功能。从 mRNA 到翻译成蛋白的过程会受到不同水平的调控，而且蛋白磷酸化等一系列转录后修饰过程可导致蛋白水平的差异，例如蛋白的降解，另外一种情况则是翻译后的蛋白不能有效运送至突触前膜上。我们的研究结果表明，阿霉素诱导的充血性心衰小鼠心脏 NET蛋白表达下调，NE的合成限速酶TH蛋白表达显著增加，表明心衰时 NET再摄取功能障碍导致 NE 在心脏的储备耗竭，NE 代偿性合成增加。但 NET mRNA和交感神经纤维密度没有变化，β肾上腺素能受体未见明显变化，提示在心衰早期即可出现 NET的再摄取功能障碍。

NET是位于中枢和外周肾上腺素能神经突触前膜上的 Na+、Cl-依赖性转运蛋白家族成员之一，与多巴胺转运蛋白（DAT）、5 羟色胺转运蛋白、γ氨基丁酸转运蛋白等具有高度同源性。NET 由 617个氨基酸组成，分子量 60～85 kDa[2]。80%～90% 的去甲肾上腺素由 NET再摄取，对于调控突触间隙和肾上腺素能受体周围的 NE 浓度，终止 NE 作用，维持受体对神经递质的敏感性起着至关重要的作用[1,2]。 交感 神 经系 统 活性 调 节紊 乱 是心 血 管疾病 的重要病理机制之一。交感神经支配的器官中，心脏NET的分布和 NE 再摄取的效率明显高于其他如肾脏 和骨 骼肌等器官[1,2]。直 立性心动过 速综合征患者 存 在 NET 基 因 缺 陷，NE 再 摄 取 功 能障碍[14,15]。在人体和动物研究中均已证实了 NET 表达和活性的 改变参与心衰的 发生发展[3-6]。心衰时心脏 NET介导的NE再摄取功能障碍，细胞外间隙长期慢性持续性NE的蓄积导致肾上腺素能受体的过度激活，并 诱 导心 肌肥厚 和心 室重构[16]。 而交 感 神经 的过度激活和肾上腺素能受体的表达下调正是β肾上腺素能受体阻滞剂治疗心衰的病理基础，但β受体阻滞剂发挥疗效需要数月的时间，对 NET 表达和功能调控机制的进一步研究有助于促进心衰的诊治进展。研究显示 NET表达和活性的降低发生在心 衰 早期[5]， 动物实 验 证实 增 加 NET 的表 达 或改善其功能可以改善心室重构和心功能：在心衰兔模型中利用转基因技术于心肌中过表达 NET 可以增加 NE的再摄取，结果显示左心室内径缩小，射血分 数增 加， 同时心肌 β 受体的 下调 被逆转[17]；而在心衰大鼠星状神经节中注射神经生长因子可以增加 NE 的再摄取，改善左心室功能[18]。心脏移植前患者经左心室辅助装置治疗后心功能改善的同时伴随 NET 蛋 白 表达 的 显著 增 加[6]。小 剂 量卡 维 地洛在充血性心衰患者中使用1周，在不影响肾上腺素能受体的同时可以降低患者静息和运动后的NE浓度，提示卡维地洛有可能可以改善 NET 的功能[19]。以上研究均证实 NET 的表达和活性调控很有可能是心衰治疗的新靶点。

基于以上研究基础，我们证实在不影响交感兴奋性的前提下，阿霉素诱导的充血性心衰小鼠心脏NET的表达下调，心衰早期即可发生 NE 再摄取功能的障碍，NE代偿性合成增加，交感神经系统过度激活形成恶性循环。NET的表达和调控在多种疾病包括精神、神经系统及心血管疾病中发挥着重要作用。对 NET表达和功能的调控机制的进一步探讨有利于心衰的诊治进展。

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Protein Expression Changes of Norepinephrine Transporter in Adriamycin Induced Congestive Heart Failure Mice model

JIN Wen-ying, QIAO Zheng-guo, ZHENG Chun-hua, LI Su-fang, CHEN Hong.
Department of Cardiology, Peking University People’s Hospital, Beijing (100044), China

CHEN Hong, Email: chenhong0418@yahoo.com.cn

Objective: To observe the protein expression changes of norepinephrine transporter (NET) in adriamycin induced congestive heart failure (CHF) mice model.Methods: The adriamycin induced CHF mice model was established, the heart tissue and middle cervical-stellate ganglion complex (MC-SGC) were isolated. The mRNA expression of NET and adrenergic receptor (β1-AR) was detected by RT-PCR, the protein expression of NET and tyrosine hydroxylase (TH) was measured by Western blot analysis, and the cardiac sympathetic nerve fibers were examined with immunohistochemistry.Results: ① The mRNA expression of NET and β1-AR was unchanged in stellate ganglion in CHF mice. ② The protein expression was decreased in NET and increased in TH. ③ The density of sympathetic nerve fibers were unchanged in the early stage of CHF in mice model.Conclusion: The protein expression of NET was down-regulated and the unbalanced activity of sympathetic nerve may worsen the cardiac function in CHF mice model.

Norepinephrine transporter; Adriamycin; Congestive heart failure; Sympathetic nerve

2013- 06-03）

（编辑：汪碧蓉）

国家自然科学基金资助项目（No.31000472）

100044 北京市， 北京大学人民医院 心脏中心

靳文英 主治医师 博士 从事心血管疾病的基础和临床研究 Email：jjwyy@sina.com 通讯作者：陈红 Email： chenhong0418@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614（2013）06-0458 -05

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.06.015

方法： 建立阿霉素诱导的充血性心衰小鼠动物模型，分离小鼠心脏和颈交感神经节，实时荧光定量多聚酶链反应（PCR）的方法检测 NET 和肾上腺素能受体 β1-AR 的 mRNA 表达，用 Western blot方法检测 NET 和酪氨酸羟化酶（TH）的蛋白表达。免疫组化方法染色心脏交感神经纤维。

结果：①心衰小鼠心脏交感神经节中 NET 和 β1-AR 的 mRNA 表达无明显变化。②心衰小鼠心肌组织中 NET 的蛋白表达显著降低，而TH的蛋白表达上调。③心衰早期小鼠心肌交感神经纤维密度无明显变化。

结论： 充血性心衰小鼠心脏 NET 的蛋白表达存在转录后的下调，心衰早期 NET 的表达下调可导致 NE 再摄取障碍，交感神经活性失衡从而加剧心功能的恶化。