法医昆虫学死亡时间的推断与Daubert规则之思考

谢丹，彭钰龙，郭亚东，蔡继峰

（中南大学基础医学院法医学系，湖南长沙 410013）

法医昆虫学死亡时间的推断与Daubert规则之思考

谢丹，彭钰龙，郭亚东，蔡继峰

（中南大学基础医学院法医学系，湖南长沙 410013）

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断一直是法医工作的重点和难点之一，法医昆虫学在PMI推断上有着独特的优势。近年来，法医昆虫学的理论和技术不断丰富，但在研究和实践中仍然有许多问题。Daubert规则的提出，对应用法医昆虫学知识推断PMI的可信度及准确度提出了更多的要求。本文围绕Daubert规则从生态学、数量遗传学、种群遗传学、分子生物学、微生物学等角度综述了这些理论在法医昆虫学中的应用，为基础理论研究和法医实践之间搭建了一座桥梁，以便运用法医昆虫学在PMI推断中为司法实践提供更准确的依据。

法医遗传学；昆虫学；综述[文献类型]；死亡时间；Daubert规则

1 概述

法医昆虫学是指应用昆虫学以及其他自然科学的理论和技术，研究并解决司法实践中有关昆虫及节肢动物的一门学科[1]。根据昆虫学有关知识并结合相关理论，法医工作者可以对尸体的死亡时间（postmortem interval，PMI）、死亡地点、死亡原因等内容进行分析判断，尤其对PMI的推断意义重大，从而为司法实践提供依据[1-2]。Daubert规则的提出为完善法医昆虫学对推断PMI的研究提供了有力的标准和指南，其核心内容是指作为科学证据的理论或技术必须满足以下4点要求[2]：（1）争论中的理论或技术是否可以检测并受到过检验；（2）该理论或技术是否被同行评估过并公开出版；（3）在使用科学技术的案件中，已知的和潜在的错误率是多少，且是否存在控制该技术操作的标准；（4）普遍接受可以作为决定特定证据可采性的重要因素。

2009年国际会议上有学者[3]围绕Daubert规则对法医昆虫学进行了深刻的总结，对PMI推断的准确性提出了更高要求。Tomberlin等[2]指出真正的PMI可以分为两个阶段，即机体死亡至昆虫接触尸体之前（pre-colonization interval，pre-CI）和昆虫集落在尸体上并繁衍后代到尸体被发现（post-colonization interval，post-CI），并定义了昆虫在尸体上活跃的时间（period of insect activity，PIA）。从目前国际上对法医昆虫学的研究来看，对于pre-CI阶段存在大量的假设和猜测，进而影响法医工作者推断PMI的准确性，违背Daubert规则的具体要求。为了尽可能准确地推断PMI，法医工作者不仅要研究昆虫在尸体上的演替规律，更需要弄清楚在pre-CI阶段某些细菌等微生物与尸体的相互作用及变化过程。此外，在法医昆虫学推断PMI的研究和工作中要充分考虑多学科理论所发挥的作用。基于Daubert规则并结合有关尸体PMI推断的相关理论分析，本文对生态学、分子生物学、数量遗传学、种群遗传学、微生物学等理论在法医昆虫学中的应用进行阐述，为基础理论研究和法医实践之间搭建一座桥梁，以便在PMI的推断上提供更准确的依据。

2 生态学在法医昆虫学中的应用

生态学[4]是研究生态系统中生物与周围环境之间相互作用关系及其作用机理的学科。通过研究生态学了解环境对昆虫演替的作用可以帮助法医工作者更准确地推断PMI。生态系统[4]由生产者（绿色植物）、消费者（肉食动物和草食动物）、分解者（微生物）等生物因素和温度、湿度、周围环境、能量流动、食物链等非生物因素共同组成，各个因素对昆虫的演替都存在或多或少的影响。2008年Yang等[5]首次定义“能量流”，并将尸体分解与周围庞大的生态系统关联起来。Gomes等[6]对不同温度环境下粪蝇的钻洞行为进行研究，证实了温度对昆虫的某些习性有着很大影响。汪海洋等[7]研究不同温度条件下棕尾别麻蝇的生长发育情况来推断PMI。Tomberlin等[2]则通过将6只处死的猪放置在不同的环境中并在同一时间对尸体进行拍摄，明显地对比分析出不同自然条件下演替的多样性。此外，Ames等[8]研究低温下蝇类的演替规律，证实温度对于应用法医昆虫学推断PMI的偏差有较大影响。因此，了解尸体上的昆虫在不同环境下的不同行为活动有利于更好地推断PIA。同时，昆虫有着固有的生活习性和个体属性，了解这些昆虫在犯罪现场中特定种群的发展阶段，能为PMI的推断提供重要的信息[1，4]。在整个生态系统中，细菌和昆虫都是通过消耗有机物质和循环利用能量与营养物质的方法分解尸体，两者之间既相互影响又相互竞争。当机体死亡后，细菌开始消耗蛋白质、脂类和碳水化合物，然后产生气体或液体吸引昆虫聚集于尸体上。大多数情况下最先聚集于尸体上的是成虫，它们在尸体上产卵并形成幼虫，成虫及幼虫继续吞食尸体。要准确地推断尸体的PMI，必须详细了解昆虫演替与周围生态系统的相互作用，才能更好地满足Daubert规则的要求以及为推断PIA提供强有力的证据。

3 分子生物学技术在法医昆虫学中的应用

快速而又准确地辨认昆虫的种类是法医昆虫学推断PMI的重要步骤。尽管传统的形态学种类鉴定方法能够鉴定出大多数种类，但是分子生物学技术对于澄清某些形态特征极其相似的近缘种、近似种和种以下的亚种、生物型、地理种群，以及对一些不具明显形态鉴别特征的卵、幼虫和蛹等的鉴定起到了积极作用[9]。更重要的是，分子生物学技术[10]从分子水平上研究种类的差异，是一种最为可靠的鉴定方法，能够及早作出对昆虫种类的鉴定和对昆虫演替过程的时间推断，为案件侦查迅速地提供准确的证据，减少错误率，从而使法医昆虫学在推断PMI上更好地满足Daubert规则的要求。

多年来DNA分子技术的应用给法医昆虫学的种类鉴定带来了便捷，用于种类鉴定的DNA分析方法有：（1）随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）。自90年代初RAPD技术就开始在昆虫种类鉴定中被广泛应用[11]。（2）限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。1994年Sperling等[12]第一个用RFLP技术鉴定了3种常见的丽蝇（Calliphoridae），即伏蝇（Phormia regina）、丝光绿蝇（Lucilia sericata）和亮绿蝇（Lucilia illustris）。随后Schroeder等[13]用RFLP技术迅速、准确地区分人类尸体上的丽蝇科（Calliphoridae）幼虫，有助于勘查人员迅速做出PMI的推断；（3）扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。Beckert等[14]利用AFLP技术对丽蝇科（Calliphoridae）和麻蝇科（Sarcophagidae）进行种群结构分析。（4）DNA序列分析。DNA序列分析是通过直接比较不同种类的同源性核酸的核苷酸排列顺序，构建发育树，并推断其系统演化关系。2001年Wells等[15]利用COⅠ和COⅡ全序列对北美地区（美国及加拿大）金蝇亚科（Chrysomyinae）十多个种进行了成功鉴定，随后Stevens等[16-17]均应用COⅠ和COⅡ全序列对所在地区的丽蝇科（Calliphoridae）、麻蝇科（Sarcophagidae）种类进行分析鉴定，证实具有较高的鉴别效力，然而为了确保基因序列的准确性，全序列分析需要大量引物片段进行拼接。Schroeder等[13]最多一次全序列分析使用了18对引物，Wells等[9]又指出并不需要在所有研究中采用全序列分析，这并不利于嗜尸性昆虫分子标记的推广和应用，鼓励寻找信息含量丰富的关键序列。因而近几年来，分子鉴定所涉及的序列种类和长度逐渐多元化，如ITS2序列[18]、635bp COⅡ[15]、288bp 16S rDNA[19]等，但这些小片段却存在一定的不足，仍需进一步的研究。DNA分子鉴定方法虽然目前仍不完善，但作为形态学鉴定方法的补充手段正在不断发展和成熟。

但仅靠传统经典的PCR、DNA技术已不能适应法医昆虫学和满足Daubert规则的要求。近年来，种属特异PCR技术[20]、实时PCR技术[21]和单核苷酸序列多态性技术[22]等对种属鉴定具有更高精确性。与此同时，应用从法医相关性昆虫体内提取物中进行人类DNA分析的技术已经成为研究热点之一。嗜尸性蝇类的蝇蛆是人类DNA的理想检测对象之一，通过对蝇蛆肠道内容物的遗传分析，既可以为受害人的个体识别与同一认定提供帮助，也可以判断嫌疑犯与犯罪事实的关联性，还可以应用于犯罪现场重建以及确定目击者描述的可信性（辨别伪证）[1]。Zehner等[23]通过对丽蝇科（Calliphoridae）、麻蝇科（Sarcophagidae）和家蝇科（Muscidae）的蝇蛆嗉囊内容物进行STR分型，发现分型结果不受蝇蛆种类影响。Li等[24]在实践案件中应用STR分型完成了巨尾阿丽蝇（Aldrichina grahami）幼虫嗉囊内容物与尸体的同一认定。虽然新的分子生物学技术在法医昆虫推断PMI的研究和应用发展迅速，然而，该理论或技术尚缺乏被同行评估、缺乏已知的和潜在的错误率及存在控制该技术操作的具体而规范的标准，要完全满足Daubert规则的要求，真正发挥证据的作用，还需不断地丰富完善和进一步的验证。

4 数量遗传学在法医昆虫学中的应用

数量遗传学[25]是采用数学分析方法研究数量性状的遗传学分支学科。其研究包括两方面：（1）不同遗传交配设计中数量性状的遗传动态；（2）用生物学统计技术对群体的某种数量性状进行随机抽样测量计算出平均数和方差，并在此基础上进行数学分析。表型值P=基因型值G+环境值E（其中基因型是表示决定一个生物体的结构和功能全部遗传特征，表型值是特定环境中一个生物体所表现的生理、形态和行为等所有特征的综合）。Tomberlin等[2]则进一步指出P=G+ E+G×E，也就是说相同基因型的个体在不同环境中可以显示出不同的表型，而在相同环境下不同的基因所出现的表型也不同。这与Demont等[26]指出的观点不谋而合：基因的多样化并不能完全解释自然条件下种群表型的不同，因为还会受到环境的影响。Tomberlin等[27]对昆虫卵巢的大小进行详细的研究和取证，通过研究卵巢的生长速度推断出昆虫在尸体上的演替情况。为了获得更多的法医学证据，需要对昆虫的各种属性如昆虫的长度、质量、大小、发展速度和腹段异常生长速度等作更详细的研究。结合数量遗传学中的数学分析方法，寻求昆虫的某种属性的演替规律与周围环境之间的对应情形，明确表型与基因型和环境的关系，深入了解在不同环境下昆虫的实际演替情况，减少周围环境对推断PMI所带来的误差，从而更好地满足Daubert规则的要求以及为推断PIA提供强有力的证据。

5 种群遗传学在法医昆虫学中的应用

种群遗传学[28]是研究种群遗传过程（包括选择、基因流、突变和遗传漂变等）的学科。通过对种群遗传学的研究，特别是对昆虫的种群差异性分析，可以确定昆虫种群之间的基因型与表型，进而利用特殊昆虫种群的特定演替规律，可以更好地推断PIA，还有助于判断地区特异性。种群结构[28]是指种群内某些生物学、生态学，乃至生理学特性互不相同的各类个体群在总体中所占的比例状况，或在总体中出现的频率分布状况。表现各异的个体群主要是指处于各发育阶段（如昆虫的虫态，虫龄）的个体集合，雌性或雄性个体集合，有翅或无翅、长翅或短翅等出现不同生物型的个体集合，以及在遗传上表现出不同基因型的个体集合等。Wright[29]提出的近交系数的研究能够识别种群之间的差异性。Beckert等[14]利用AFLP技术对各种蝇类进行种群结构分析，研究尸体上蝇类内部基因流的改变。王永模等[30]综述了微卫星遗传标记技术在昆虫种群遗传结构分析中的有效作用。正确认识种群结构之间的差异、种群之间的相互竞争、种群中基因流的改变特征以及种群数量变动的机制，对深入探讨昆虫在尸体上演替的规律和机制，进而对推测PMI及满足Daubert规则的要求无疑是大有益处。

6 微生物学在法医昆虫学中的应用

为了进一步提高推断PMI的准确性，法医工作者有必要弄清楚pre-CI阶段中尸体的变化过程。然而，至今为止人们对于这一阶段的认识依然非常浅显。在pre-CI阶段，昆虫并没有接触尸体，细菌在尸体的变化过程中起到了决定性的作用。心脏停止跳动后，人体的免疫系统全部瘫痪，尸体组织蛋白在体内外细菌的共同作用下开始分解，同时释放出腐败气体。这些气体会吸引一些食腐昆虫来此定居产卵。不同细菌的分解产物不同，吸引的昆虫种类和昆虫到达的时间也就不同。综合相关的研究，pre-CI阶段又可以细分为3个阶段[2，27]：（1）尸体暴露阶段，细菌分解尸体产生大量的硫化物和氮化物气体，从而向昆虫发出的刺激信号。杨海凌等[31]通过对昆虫嗅觉受体的研究，认识到细菌发出的气味分子配体与昆虫的G蛋白偶联受体相结合使得昆虫产生一系列的神经反应。Mombaerts[32]同样指出从无脊椎动物到人类，很多气味信号都是由挥发性配体结合到属于G蛋白偶联受体家族的气味受体上。随着对气味受体基因的进一步理解和深入研究，认识微生物对昆虫接近尸体的影响有助于更准确地推断pre-CI。（2）发现阶段，目标昆虫发现尸体是由外部刺激如温度、湿度、风速、降水和昆虫的内部因素如交配情况、发育情况等共同作用的结果。（3）接触阶段，昆虫接触尸体，并开始在尸体上繁衍后代。研究[10]表明，一般来说，最先出现在尸体上的是丽蝇科（Calliphoridae）等双翅目昆虫。Burkepile等[33]以节肢动物为例来探讨微生物对尸体吸引动物的影响，实验对比分析了3种不同尸体（新鲜尸体、携带细菌的不新鲜尸体和用广谱抗生素氯霉素处理过的不新鲜尸体）吸引石墨尼珀哈蟹的效果，结果表明，携带细菌的不新鲜尸体是新鲜尸体逃避被蟹采食的4倍。总之，生有细菌的尸体和无细菌的新鲜尸体对节肢动物的吸引是有差距的。

由此可见，微生物在影响昆虫到达尸体的时间上起了重要作用，法医工作者有必要深入认识微生物与有机体之间的相互作用，而在这过程中，气味信号是两者互相作用的中介物。一方面，微生物如何作用于尸体产生特定的气味信号；另一方面，特定的气味信号在一定的周围环境中如何吸引特定的昆虫。在解答这些疑问的基础上准确推断pre-CI，使PMI推断进一步满足Daubert规则的要求。

7 展望

法医昆虫学是一门复杂的与多学科联系紧密的学科，如何将各学科理论研究和法医实践充分地融合仍然是该领域研究的核心内容。Tomberlin等[2]最近提出了基础学科在法医昆虫学的应用框架，试图为法医昆虫学的发展提供指导方向。但是法医昆虫学推断PMI是一门实践科学。综上所述，生态学、分子生物学、数量遗传学、种群遗传学和微生物学等基础理论在法医昆虫学中的应用还不成熟，尤其是微生物领域仍处于探索阶段，需要大量的实践积累。法医昆虫学今后的发展也将以Daubert规则为指导，跟随各种自然科学理论与技术的发展，将更为精准的先进理论和技术有效地应用在法医昆虫学推断PMI的各个环节上，从而为法庭提供更加准确的依据。

[1]蔡继峰.现代法医昆虫学[M].北京：人民卫生出版社，2011.

[2]Tomberlin JK，Mohr R，Benbow ME，et al.A roadmap for bridging basic and applied research in forensic entomology[J].Annu Rev Entomol，2011，56：401-421.

[3]National Research Council.Strengthening forensic science in the united states:a path forward[R].Washington DC：National Academy Press，2009：1-252.

[4]戈峰.昆虫生态学原理与方法[M].北京：高等教育出版社，2008.

[5]Yang LH，Bastow JL，Spence KO，et al.What can we learn from resource pulses?[J].Ecology，2008，89（3）：621-634.

[6]Gomes L，Gomes G，Von Zuben CJ.The influence of temperature on the behavior of burrowing in larvae of the blowflies，Chrysomya albiceps and Lucilia cuprina，under controlled conditions[J].J Insect Sci，2009，9：14.

[7]汪海洋，时燕薇，刘小山，等.不同温度条件下棕尾别麻蝇的生长发育及其在法医学上的意义[J].环境昆虫学报，2010，32（2）：166-172.

[8]Ames C，Turner B.Low temperature episodes in development of blowflies：implications for postmortem interval estimation[J].Med Vet Entomol，2003，17（2）：178-186.

[9]Wells JD，Stevens JR.Application of DNA-based methods in forensic entomology[J].Annu Rev Entomol，2008，53：103-120.

[10]Amendt J，Campobasso CP，Goff ML，et al.Current concepts in forensic entomology[M].Dordrecht，Heidelberg，London，New York，Springer：2010.

[11]Stevens J，Wall R.The use of random amplified polymorphic DNA（RAPD）analysis for studies of genetic variation in populations of the blowfly Lucilia sericata（Diptera：Calliphoridae）in southern England[J]. Bull Entomol Res，1995，85（4）：549-555.

[12]Sperling FA，Anderson GS，Hickey DA.A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation[J].J Forensic Sci，1994，39（2）：418-427.

[13]Schroeder H，Klotzbach H，Elias S，et al.Use of PCR-RFLP for differentiation ofcalliphorid larvae（Diptera，Calliphoridae）on human corpses[J].Forensic Sci Int，2003，132（1）：76-81.

[14]Beckert JC，Friedland DE，Wallace MM.Genotyping diptera using amplified fragment length polymorphism（AFLP）：development of a genetic marker system for species in the families Calliphoridae and Sarcophagidae[J].Aust J Forensic Sci，2010，42（2）：141-152.

[15]Wells JD，Sperling FA.DNA-based identification of forensically important Chrysomyinae（Diptera：Calliphoridae）[J].Forensic Sci Int，2001，120（1-2）：110-115.

[16]Stevens JR，Wall R，Wells JD.Paraphyly in Hawaiian hybrid blowfly populations and the evolutionary history of anthropophilic species[J].Insect Mol Biol，2002，11（2）：141-148.

[17]Mazzanti M，Alessandrini F，Tagliabracci A，et al.DNA degradation and genetic analysis of empty puparia：genetic identification limits in forensic entomology[J].Forensic Sci Int，2010，195（1-3）：99-102.

[18]Song Z，Wang X，Liang G.Species identification of some common necrophagous flies in Guangdong province，southern China based on the rDNA internal transcribed spacer 2（ITS2）[J].Forensic Sci Int，2008，175（1）：17-22.

[19]Li X，Cai JF，Guo YD，et al.The availability of 16S rRNA for the identification of forensically important flies（Diptera：Muscidae）in China[J].Trop Biomed，2010，27（2）：155-166.

[20]Rodríguez MA，García T，González I，et al.Identification of goose，mule duck，chicken，turkey，and swine in foie gras by species-specific polymerase chain reaction[J].J Agric Food Chem，2003，51（6）：1524-1529.

[21]Dooley JJ，Paine KE，Garrett SD，et al.Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays[J]. Meat Sci，2004，68（3）：431-438.

[22]Budowle B.SNP typing strategies[J].Forensic Sci Int，2004，146（S0）：139-142.

[23]Zehner R，Amendt J，Krettek R.STR typing of human DNA from fly larvae fed on decomposing bodies[J].J Forensic Sci，2004，49（2）：337-340.

[24]Li X，Cai JF，Guo YD，et al.Mitochondrial DNA and STRanalyses for human DNAfrom maggots crop contents：a forensic entomology case from centralsouthern China[J].Trop Biomed，2011，28（2）：333-338.

[25]盛志廉，陈瑶生.数量遗传学[M].北京：科学出版社，1999.

[26]Demont M，Blanckenhorn WU，Hosken DJ，et al. Molecularandquantitativegeneticdifferentiation across Europe in yellow dung flies[J].J Evol Biol，2008，21（6）：1492-1503.

[27]Tomberlin JK，Benbow ME，Tarone AM，et al.Basic research in evolution and ecology enhances forensics[J].Trends Ecol Evol，2011，26（2）：53-55.

[28]黄族豪，刘迺发.种群遗传学研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（31）：13490-13491，13499.

[29]Wright S.The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating[J].Evolution，1965，19（3）：395-420.

[30]王永模，沈佐锐.微卫星遗传标记及其在昆虫种群遗传学中的应用[J].生物技术通报，2006，（S0）：221-224.

[31]杨海凌，陈晶，齐义鹏.昆虫嗅觉受体最新研究进展[J].科技资讯，2008，（31）：12-13，15.

[32]Mombaerts P.Seven-transmembrane proteins as odorant and chemosensory receptors[J].Science，1999，286（5440）：707-711.

[33]Burkepile DE，Parker JD，Woodson CB，et al.Chemically mediated competition between microbes and animals：microbes as consumers in food webs[J].Ecology，2006，87（11）：2821-2831.

Reflection of Estimating Postmortem Interval in Forensic Entomology and the Daubert Standard

XIE Dan,PENG Yu-long,GUO Ya-dong,CAI Ji-feng
（Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Science,Central South University,Changsha 410013,China）

Estimating postmortem interval（PMI）is always the emphasis and difficulty in forensic practice. Forensic entomology plays a significant indispensable role.Recently,the theories and technologies of forensic entomology are increasingly rich.But many problems remain in the research and practice.With proposing the Daubert standard,the reliability and accuracy of estimation PMI by forensic entomology need more demands.This review summarizes the application of the Daubert standard in several aspects of ecology,quantitative genetics,population genetics,molecular biology,and microbiology in the practice of forensic entomology.It builds a bridge for basic research and forensic practice to provide higher accuracy for estimating postmortem interval by forensic entomology.

forensic genetics;entomology;review[publication type];postmortem interval;Daubert standard

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.014

1004-5619（2013）04-0290-05

2012-04-01）

（本文编辑：李成涛）

湖南省自然科学基金资助项目（11JJ5075）

谢丹（1986—），女，湖南娄底人，硕士研究生，主要从事法医昆虫学研究；E-mail：xiejiang0519@163.com

蔡继峰，男，副教授，主要从事法医昆虫学研究；E-mail：cjf_jifeng@163.com