HPLC法测定得生片中芍药苷含量*

尹静文， 吴贵华，王杏林

(1.天津医科大学，天津　300070；　2.天津市药品检验所，天津　3000070；　3.天津药物研究院，天津　300193)

得生片由益母草、柴胡、当归、川芎、白芍、木香6味药材组成，具有调经养血，理气化瘀之功效。处方中白芍可养血柔肝，芍药苷是白芍的主要有效成分之一。采用HPLC测定得生片中芍药苷含量的方法可用于得生片质量控制，并可对生产中使用的白芍药材质量提供客观评价。

1　仪器与试药

日本SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，LC solution工作站。芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110736-201035)，得生片(天津某药品生产企业生产，批号1008003、 1004001、1006002)。甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾(分析纯，华东试剂厂)。水为去离子水。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为Agilent -C18(250 mm×4.6 mm，5 μm); 以甲醇-0.1%磷酸缓冲盐(pH为7.4) (21∶79)为流动相；检测波长为230 nm，柱温：40 ℃ ；流速：1 ml/min。理论板数按芍药苷峰计算应不低于4000。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备取装量差异项下的样品，研细，取约1 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，摇匀，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备按处方取除白芍的各味药材，按制法制得片剂样品，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。

2.3阴性对照试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件分析。结果阴性样品在芍药苷色谱峰对应的保留时间无干扰。见图1。

1.芍药苷

2.4线性关系考查分别精密移取“2.2.1”项下芍药苷对照品溶液15、25、50、、75和100 μl至50 ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列溶液，按“2.1”项下方法测定，记录色谱图和峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：Y=1.377 767×106X+8.793×103(r=0.9999)。结果表明芍药苷在0.120 78～1.0065 μg范围内线性良好。

2.5进样精密度试验取同一批(批号1008003)样品，研细，取约1 g，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定样品中芍药苷峰面积，峰面积的RSD为0.67%，符合要求。

2.6重复性试验取同一批(批号1008003)样品，共6份，研细，取约1 g，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，测定每份样品中芍药苷含量。结果表明样品中芍药苷平均含量为1.5688 mg/g，RSD为1.4%，符合要求。

2.7稳定性试验取同一批(批号1008003)样品，研细，取约1 g，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，分别在0、3、6、9、12和15 h测定样品中芍药苷峰面积，测得峰面积值的RSD为 0.67%，符合要求。

2.8回收率试验取同一批(批号1008003)样品，研细，取约0.5 g，共6份，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入芍药苷对照品70%甲醇溶液(0.040 26 mg/ml)20 ml，精密加入70%甲醇5 ml，再按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率，结果显示平均回收率为101.9%，RSD为1.30%，符合规定。见表1。

表1　加样回收率试验测定结果

2.9样品含量测定取3个批号的样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件测定样品中芍药苷含量。结果分别为1.6465、1.5925和1.5805 mg/g(n=2)。

3　讨论

3.1流动相的选择高效液相法测定芍药苷含量时，在《中国药典》等现行标准[1]中采用有多种流动相系统。试验中对甲醇-水(25∶75)、乙腈-水(15∶85)、乙腈-冰醋酸-水(16∶1∶8)及甲醇-0.1%磷酸缓冲盐(pH为7.4)(21∶79)等进行选择。前3种流动相，存在多种问题，尤其是为克服杂质干扰，芍药苷色谱峰出峰保留时间较长时，色谱峰拖尾严重，对测定结果有一定影响。根据试验选择了甲醇-0.1%磷酸缓冲盐(pH为7.4)(21∶79)作为本方法的流动相，其效果较好，色谱峰不拖尾，可达到基线分离，分离度符合要求。

3.2提取方法的选择

3.2.1提取溶剂 取同一批(批号1008003)样品，研细，取约1 g 3份，精密称定，分别精密加入甲醇、70%甲醇和50%甲醇各25 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用各自的溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，分别测定样品中芍药苷含量。结果表明，用甲醇提取的结果含量较低，为1.1398 mg/g，以50%、70%甲醇提取结果为1.5939 mg/g，RSD(%)仅为0.53%，无显著差别。采用低浓度甲醇，在试验操作中难于过滤，试验误差也较大。上述试验用70%甲醇提取的结果含量最高，试验操作便利，故本试验采用70%甲醇为提取溶剂。

3.2.2提取方式取同一批(批号1008003)样品，研细，取约1 g 4份，精密称定，精密加入70%甲醇25 ml，称定重量，分别超声处理或加热回流60 min，放冷，称定各自重量，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，测定样品中芍药苷含量分别为1.5954和1.5750 mg/g(n=2)。4份测定结果RSD为0.65%，说明采用超声处理和加热回流两种提取方式，测定结果基本相同。但超声处理较简便，故选择超声处理为样品的提取方式。

3.2.3提取时间取同一批(批号1008003)样品，研细，取约1 g 8份，精密称定，分别精密加入70%甲醇25 ml，称定重量，分别超声处理30、45、60或90 min，放冷，再称定各自重量，用70%甲醇补足减失各自的重量，滤过，取续滤液，测定样品中芍药苷的含量分别为1.5678、1.5723、1.5929和1.5688 mg/g(n=2)，RSD为0.6%。测定结果无明显区别，但超声60 min提取的结果含量最高，故选定超声处理时间为60 min。

3.3耐用性试验取重现性试验中5、6号样品溶液，使用日本SHIMADZU LC-2010AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，LC solution工作站。分别使用 Diamonsil - C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，Sepax Sappire C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱和Agilent -C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，按照“2.1”项下色谱条件分析，测定样品中芍药苷含量。结果表明采用3种不同色谱柱测定结果分别为1.5867、1.5855和1.5826 mg/g，RSD为0.34%，无显著性差异，表明该含量测定方法耐受性良好，具有可行性。

1中国药典[S].一部.2010：95-96