参附注射液对脓毒症大鼠心血管功能和心肌氧化应激的改善作用

马伟斌 江荣林 雷澍 王灵聪 吴建浓 黄立权 吴艳春 智屹惠朱美飞

参附注射液对脓毒症大鼠心血管功能和心肌氧化应激的改善作用

马伟斌 江荣林 雷澍 王灵聪 吴建浓 黄立权 吴艳春 智屹惠朱美飞

目的 观察参附注射液对脓毒症大鼠心血管功能和心肌氧化应激的改善作用。 方法 采用结扎穿孔盲肠法制备腹腔感染脓毒症动物模型。将180只SD大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组、脓毒症（CLP）组、参附注射液低剂量（LSF）组、参附注射液高剂量（HSF）组，每组各20只。记录手术后6、18 h各组的平均动脉压（MAP）、心率（HR）、左室收缩压（LVDP）和左室最大收缩速率（+dP/dt）、左室舒张压（LVEDP）和左室最大舒张速率（-dP/dt）、心肌细胞凋亡发生率（AI）、心脏组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、呼吸控制比（RCR）。 结果 与Sham组比较，CLP组术后6h时的HR显著升高（P＜0．05），但术后18h时的HR有所降低（P＜0．01）；术后6、18h的MAP、LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt、SOD、RCR均显著下降（均P＜0．01），AI、MDA均显著升高（P＜0．05或0．01）。而与CLP组比较，LSF组术后6h的MAP和HR、HSF组术后6h的HR差异均无统计学意义（均P＞0．05），但HSF组术后6h的MAP及LSF、HSF组术后18h的HR、MAP均明显升高（P＜0．05或0．01）；LSF组和HSF组术后6、18h的LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt、SOD、RCR均显著升高（P＜0．05或0．01）；LSF组和HSF组术后6、18h的AI、MDA均显著降低（P＜0．05或0．01）。结论 参附注射液可改善脓毒症大鼠的左室收缩和舒张功能，减少心肌细胞凋亡和心肌组织MDA含量，增加SOD活性，保护线粒体功能，且这些作用的强度与参附注射液药物剂量成正比。

参附注射液 脓毒症 大鼠 心血管 氧化应激

脓毒症是临床常见的危重症，主要表现为血流动力学不稳定和组织细胞氧代谢障碍，极易发展为脓毒症休克和多脏器功能障碍综合征（MODS）。目前临床上仍未找到有效方法阻断其发生、发展，且疗效不佳，病死率高达45%～70%。参附注射液是经典的益气温阳类药物，是一种以红参、附片为主要成份的中成药，具有回阳救逆、益气固脱的作用，主要用于阳气暴脱的厥脱症等（感染性、失血性、低血容量性休克等），尤其是脓毒性休克危重状态下的急救。笔者通过观察参附注射液对脓毒症模型大鼠心血管功能和心肌氧化应激的影响，探讨其改善重度脓毒症患者氧代谢异常的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，体重200～250g，平均（223±21）g，由浙江大学实验动物中心提供。所有大鼠均自由觅食水。参附注射液（主要成份：红参、黑附片提取物）由四川雅安三九药业有限公司生产（批号：国药准字Z2004-3117，50ml/瓶）；3%戊巴比妥钠由浙江大学实验中心配置；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考马斯亮蓝试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；蛋白酶K、0.3%H2O2甲醇溶液、核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶混和液、辣根过氧化物酶等均为国产分析纯。低温离心机（Eppendorf公司，5804型），恒温水浴箱（Heto-Holten公司，SBD50型），紫外分光光度计（上海生化仪器厂），MedLab生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司）。

1.2 方法 采用结扎穿孔盲肠法制备重度脓毒症休克模型。将大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组、脓毒症（CLP）组、参附注射液低剂量（LSF）组、参附注射液高剂量（HSF）组，每组各20只。Sham组：仅行开腹手术，但不结扎穿孔盲肠。CLP组：开腹手术后结扎穿孔盲肠，10min后经股静脉微量泵推注0.9%氯化钠注射液10ml/kg。HSF组：开腹手术后结扎穿孔盲肠，10min后经股静脉微量泵推注参附注射液10ml/kg。LSF组：开腹手术后结扎穿孔盲肠，10min后经股静脉微量泵推注0.9%氯化钠注射液5ml/kg与参附注射液5ml/kg。

1.3 监测指标 将每组大鼠按随机数字表法再分为两组，每组各10只，分别于手术后6、18h记录相关指标。

1.3.1 大鼠血压的记录和左室功能评价 予3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉，行股动脉插管，通过压力传感器连接于MedLab生物信号采集处理系统，记录平均动脉压（MAP）。行左心室插管，通过MedLab生物信号采集处理系统记录左室收缩曲线，并记录心电图。计算心脏收缩功能指标左室收缩压（left ventricular developed pressure，LVDP）、左室最大收缩速率（+dP/dt），心脏舒张功能指标左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室最大舒张速率（-dP/dt）以及心率（HR）等指标。

1.3.2 凋亡细胞的检测 采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色检测凋亡的发生。心肌标本用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。将组织切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，37℃下用蛋白酶K处理30min后再用PBS缓冲液（phosphate buffered saline）冲洗；0.3%H2O2甲醇溶液室温下孵育30min，PBS缓冲液冲洗后加入用荧光标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶的混和液，37℃水浴箱中反应60min，PBS缓冲液冲洗；加辣根过氧化物酶孵育30min（37℃），PBS缓冲液冲洗；DAB显色（避光），苏木素复染后脱水，透明，封片。在高倍镜下（10×40）检测，凋亡阳性细胞核呈棕黄色，凋亡阴性细胞核呈蓝色。以凋亡阳性细胞数目占总细胞数目的百分比作为细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.3.3 心肌组织MDA含量的测定 采用硫代巴比妥酸法测定。取10%左心室匀浆上清液，依次加入试剂盒中的试剂，旋涡混匀器混匀，置沸水浴40min，离心取上清液，蒸馏水调零，于532nm处测OD（optical density）值。采用考马斯亮蓝法[1]测定组织的蛋白含量，计算各组大鼠心脏MDA的含量。

1.3.4 心肌组织SOD活性的测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定。实验结束时取左心室，使用pH 7.4的磷酸盐缓冲液在冰浴下制成10%组织匀浆液，离心取上清液备用。使用紫外可见光分光光度计，读取440nm下各组吸光度。用考马斯亮蓝法测定组织的蛋白含量。

1.3.5 线粒体提取 心脏置于预冷的分离介质中（pH 7.4，10mmol/L Tris-HCl缓冲液，250mmol/L蔗糖，0.5mmol/L乙二胺四乙酸和0.5%牛血清白蛋白）剪碎后匀浆。匀浆液经离心（1 000r/min，10min）后，弃沉淀物。取上清液，再离心（10 000r/min，10min），弃上清液。取沉淀物用分离介质重悬后再离心（10 000转/min，10min），所得沉淀即为提取的细胞线粒体。

1.3.6 线粒体呼吸控制比（RCR）测定 RCR反映线粒体氧化磷酸化功能。参照Poderoso等[2]使用的方法，以苹果酸钠和谷氨酸钠为底物，采用Clark电极测定心肌线粒体ST3（state 3）、ST4（state 4）氧耗速率，计算RCR= ST3/ST4。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 4组大鼠心肌氧化应激指标的变化 见表1。

表1 4组大鼠心肌氧化应激指标的变化

2.1.1 MAP的变化 CLP组大鼠手术后6、18 h MAP较Sham组明显下降；LSF组6h MAP与CLP组无明显差异，但18h MAP较CLP组有显著提高；HSF组6、18h时的MAP均较CLP组明显提高，说明参附注射液可以提升脓毒症时已降低的血压。

2.1.2 HR和心功能的改变 CLP组大鼠手术后6h HR较Sham组显著增高，而手术后18 h时HR却明显下降。LSF、HSF组6h时HR与CLP组的差异无统计学意义，但有下降的趋势；而18h时LSF、HSF组的HR较CLP组有所提高。CLP组大鼠手术后6、18h时的LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt较Sham组均明显降低。LSF、HSF组6、18h时LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt较CLP组均有明显提高，表明参附注射液能不同程度地改善脓毒症时异常的HR及左心室收缩和舒张功能。

2.1.3 心肌细胞凋亡的测定 与Sham组比较，CLP组大鼠手术后6、18h心肌细胞AI均明显增加。LSF、HSF组于6、18h的心肌细胞AI均较CLP组显著降低，说明参附注射液可减少脓毒症时心肌细胞的凋亡。

2.1.4 心肌MDA和SOD的测定 与Sham组比较，CLP组大鼠手术后6、18h心肌MDA含量均显著增加，SOD活性则明显降低。手术后6、18h时，LSF、HSF组心肌MDA含量较CLP组均有明显降低，而SOD含量则有所升高，提示参附注射液能纠正脓毒症心肌细胞异常的脂质过氧化现象，并提高其清除氧自由基的能力。

2.2 4组大鼠心肌线粒体RCR的比较 见表2。

表2 4组大鼠心肌线粒体RCR的比较

由表2可见，与Sham组比较，大鼠CLP手术后6、18h心肌细胞RCR均显著降低。LSF、HSF组于6、18h的线粒体RCR较CLP组显著升高，提示参附注射液能显著改善心肌细胞线粒体内的氧代谢过程。

3 讨论

近年来研究发现，重度脓毒症患者的器官功能障碍主要是功能性而非器质性的，由于其线粒体功能障碍导致组织氧耗量降低[3-5]，使组织细胞进入乏氧代谢的过程，继而导致细胞代谢障碍。江荣林等[6]研究发现重度脓毒症患者使用参附注射液后，其氧供、氧耗和乳酸清除率得到明显提高，组织氧代谢显著改善。但这些结果均是通过临床研究发现的，具体机制尚未明确。

现代药理研究显示，参附注射液内所含人参皂苷、乌头类生物碱、人参多糖等，能改善心肌缺血，清除氧自由基，减轻心肌细胞膜脂质过氧化程度，保护心肌细胞[7]。去甲乌头碱具有拟异丙肾上腺素的作用，能增强心肌收缩力，提高窦房结和房室结兴奋性，加速房室传导，从而加快HR[8]。人参皂苷具有促进前列腺素的释放和扩张冠状动脉作用，可通过提高心肌组织cAMP/ cGMP比值而产生增强心肌收缩力，减慢HR[9]。徐志清等[10]研究亦发现参附注射液能有效改善急性心肌梗死后的左心功能，进一步证实了参附注射液的上述作用。

在重度脓毒症和脓毒性休克时，由于受到体内强烈的炎症反应所产生的TNF-α、IL-6、心肌抑制因子等炎性介质和细胞因子的影响，心肌常常处于抑制状态，使心血管功能受到较大的抑制。MAP是心血管功能的综合指标，LVDP、+dP/dt是心脏收缩功能的指标，LVEDP、-dP/dt是心脏舒张功能的指标，这些参数均能良好地反映心血管功能。本研究发现，CLP组大鼠手术后6、18h MAP明显下降（P＜0.01），而参附注射液低、高剂量可不同程度地增高CLP大鼠的MAP，说明参附注射液有提高脓毒症大鼠MAP的作用，且这一作用与参附剂量成正相关。杨芳炬等[11]研究也发现参附注射液可增加冠脉血流量，降低周围血管阻力，从而达到升高血压的目的。本研究中，CLP组大鼠术后6h HR显著加快，术后18h下降，心脏收缩、舒张功能均减弱。各剂量参附注射液对脓毒症6h时增快的HR尚不足以产生明显影响（P＞0.05），但有使其降低的作用趋势；而对18h时过慢的HR有明显的提升作用。低、高浓度的参附注射液均能显著改善CLP手术引起的LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt降低，且这一作用与参附注射液的浓度成正比，说明参附注射液确实能够改善受到抑制的心血管功能，有利于维护血流动力学稳定，有利于脓毒性休克的抗休克治疗。

诸多报道认为，心肌细胞凋亡的发生与否受Fas/ FasL、Bcl-2家族、Caspase家族等因素的调控[12-15]。本研究中CLP组大鼠术后6、18h心肌AI均明显高于Sham组，LSF、HSF组在一定程度上也可降低AI，且与浓度成正比，说明脓毒症时确实存在心肌细胞凋亡增多的现象，而参附注射液对此有一定的抑制作用。张晓膺等[16]研究也发现参附注射液对缺氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡有抑制作用，考虑可能与参附注射液具有抑制caspase-3蛋白酶活性的作用有关，但其详细机制尚有待进一步深入研究。

本研究发现，CLP组大鼠手术后6、18h心脏MDA含量显著增加，而SOD活性明显降低，说明脓毒症时存在着显著的脂质过氧化现象，但清除氧自由基的能力则明显不足。低、高浓度的参附注射液均可显著减少CLP大鼠心脏组织MDA含量，增加SOD活性，说明不同浓度的参附注射液均可显著抑制脂质过氧化并提高其清除氧自由基的能力，且这种作用与剂量成正比，反映了参附注射液对脓毒症时组织氧自由基损伤的保护作用。

RCR是评价线粒体完整性和氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标，其下降表明线粒体氧化磷酸化偶联程度降低，线粒体功能受损[17]。本研究发现，大鼠CLP手术后6、18h心脏RCR显著下降（P＜0.01），说明脓毒症时存在着显著的线粒体功能损伤；而使用低、高浓度参附注射液后大鼠RCR的下降均得到有效控制，且此作用强度与参附注射液的剂量成正比，从而显著改善线粒体内的氧代谢过程，提高氧化供能的能力。

综上所述，本研究发现在脓毒症时应用参附注射液可有助于心血管功能的改善和心肌氧化应激异常的恢复，且这些作用的强度与参附注射液药物剂量成正比，从而纠正脓毒症的病理生理状态，为脓毒症的治疗提供了新的途径。但本研究尚未涉及脓毒症模型大鼠的最终预后，且本研究结果的深层次分子生物学机制亦不清楚，尚需进一步深入研究。

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Effects of ShenFu Injection on cardiovascular function and myocardial oxidative stress in rats with sepsis

Objective To investigate the effects of ShenFu Injection(SF)on cardiovascular function and myocardial oxidative stress in rats with sepsis．Methods A total of 80 Sprague-Dawley(SD)rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture(CLP),and were randomly divided into four groups:sham operation group(n=20),sepsis group(n=20),low-SF group (n=20)and high-SF group(n=20)．Mean arterial pressure(MAP),heart rate(HR),left ventricle developed pressure(LVDP)and maximal rate of the left ventricular pressure increase(+dP/dt),left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)and maximal rate of the left ventricular pressure decrease(-dP/dt),apoptosis incidence of myocardial cells(AI),heart tissue malondialdehyde(MDA) content,superoxide dismutase (SOD)activity and respiratory control ratio (RCR)of each group were recorded 6h and 18h after the surgery．Results Compared to Sham group,HR in CLP group increased significantly 6h after surgery(P＜0．05),but decreased significantly 18h after surgery(P＜0．01)．Compared with Sham group,MAP,LVDP,+dP/dt,LVEDP,-dP/dt,SOD and RCR in CLP group all decreased significantly 6h and 18h after surgery(P＜0．01),AI and MDA increased significantly 6h and 18h after surgery(P＜0．05 or 0．01)．Compared with sepsis group,no significant differences were found in MAP and HR of LSF group 6h after surgery,and also in HR of HSF group 6h after surgery(P＞0．05)．Compared to sepsis group,MAP in HSF group 6h after surgery,HR and MAP in both LSF and HSF groups 18h after surgery all increased significantly(P＜0．05 or 0．01)．Compared to sepsis group,LVDP,+dP/dt,LVEDP,-dP/dt,SOD and RCR in both LSF and HSF groups increased significantly(P＜0．05 or 0．01) 6h and 18h after surgery．Compared to sepsis group,AI and MDA in both LSF and HSF groups decreased significantly(P＜0．05or 0．01)． Conclusion ShenFu Injection can improve heart function,decrease myocardial apoptosis,reduce myocardial MDA content,enhance SOD activity and protect mitochondrial function in septic rats．The effects are related to the dose of ShenFu Injection．

ShenFu Injection Sepsis Rats CardiovascularOxidative stress

2012-11-12）

（本文编辑：严玮雯）

（本文由浙江省医学会重症医学分会推荐）

浙江省中医药科研基金计划项目（2008CA017）

310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院药剂科（马伟斌），ICU（江荣林、雷澍、王灵聪、吴建浓、黄立权、吴艳春、智屹惠、朱美飞）

江荣林，E-mail:jiangronglin@126.com