山羊miRNA研究进展*

李转见，韩瑞丽，蓝贤勇，陈 宏*

(1. 河南农业大学牧医工程学院/河南省家禽种质资源创新工程研究中心，河南 郑州 450002；2. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

miRNA是一类单链内源非编码RNA，长约18～25 nt (Nucleotide, nt)。在转录水平能够与靶mRNA的特定序列结合，通过降解靶mRNA或抑制翻译发挥其重要调控作用[1]。自从第一个miRNA基因(lin-4)被发现和鉴定以来[2]，至今已20多年的时间过去了。miRNA已被广泛的研究，几乎涉及了所有的植物，动物和微生物[3]，且研究表明miRNA参与了生命各种调节途径，包括细胞增殖与分化、激素的分泌、新陈代谢、肌肉和脂肪的形成发育、免疫应答反应、疾病的发生和肿瘤的形成等。这些研究主要集中在人和小鼠上。随着高通量测序技术的成熟，miRNA在畜牧学中的研究发展极为迅速[4]。迄今为止，miRNA数据库(http://www.mirbase.org/)中牛的miRNA有783个，鸡的有996个，猪的有326个，绵羊的有153个。而山羊作为人类驯化最早的动物之一，为我们的生活提供了奶、肉、羊毛、绒及皮革等多种生活用品，可是目前关于山羊miRNA的研究报道还不多见，miRNA数据库中仍没有山羊miRNA的数据。

1 miRNA的发现，合成及生物学作用

1993年Victor Ambros进行的一项研究中发现：秀丽线虫lin-4基因编码一个小RNA并与lin-14基因的3’UTR (Untranslated Regions, UTR)区互补，在转录后水平抑制lin-14基因的表达[2]。这个发现第一次证明了一个新小非编码RNA介导的调控机制。这些非编码RNA由一类小RNA组成，已发现的小RNA大多数在编码蛋白基因的内含子区或基因间区。然而，最近发现也有一部分小RNA存在编码蛋白基因的外显子区。在真核生物的基因组发现了成百上千的miRNA，当然很多miRNA也可能至今没被发现。在哺乳动物中约60%编码蛋白基因受到miRNA的分子调控[5]。

miRNA基因在细胞核内经RNA聚合酶II转录成pri-miRNA(一般大于200 nt，最长可达上千个nt)，pri-miRNA转录本在Drosha-DGCR8蛋白的修饰，剪接作用下形成一个具有茎环发夹结构的小分子pre-miRNA(一般长70～110 nt)，接着pre-miRNA由Exportin-5蛋白运输到细胞核外。pre-miRNA在细胞质中经过Dicer酶的剪切加工，切去了茎环发夹结构形成短的双链小RNA分子。双链的小RNA分子在解旋酶的作用下生成单链的小RNA分子，其中一条单链降解，另一个链形成成熟的miRNA，成熟的miRNA与诱导沉默复合物结合后作用靶基因的3’UTR区从而发挥miRNA转录后的调控作用[6]。

在哺乳动物中，miRNA与靶基因互补配对致使翻译效率降低或降解mRNA的水平，可是，相对来说这两种调控机制中哪一种是主要的调控方式呢？Guo等[7]人利用核糖体图谱技术来研究蛋白生成的总体效率同时比较mRNA表达量。在miRNA的调控下，低水平的mRNA对降低蛋白合成的贡献占84%。这些结果表明miRNA调控基因表达的效应是直接通过改变mRNA水平来实现的。因此，靶基因降解是降低蛋白合成的最主要原因。miRNA通过结合靶基因靶位点来抑制基因的表达或者降解靶基因的mRNA水平来实现对基因的调控。miRNA靶位点大多数在靶基因的3’UTR区。很多研究表明miRNA与靶位点部分序列互补就足以降低靶基因的表达。由于互补部分的序列很少，使得对miRNA靶基因的预测变得困难。尽管报道了相关标准以帮助预测miRNA的靶位点，然而目前没有明确公认的统一标准。一个预测靶基因的主要决定因素是miRNA的5’端有6～8个核苷酸与靶基因的mRNA的3’端精确互补，这miRNA的5’端有6～8个核苷酸被称之为“种子序列”[8]。即使发现存在一个精确的种子序列与它潜在的靶位点完全互补，这样也不能完全满足miRNA的靶位点条件。一个研究表明，秀丽线虫let-6 miRNA种子序列完全匹配不是它靶向靶基因的充要条件，一个种子区的G∶U的错配没有影响到let-6对靶基因的调控[9]。miRNA:mRNA互补形成双链的热动力学稳定性可以被计算作为一个双链的自由能，这是miRNA靶向基因的另一个决定因素[10]。miRNA靶位点预测算法主要用种子序列的匹配和miRNA:mRNA互补形成双链的热动力学稳定性，这两个因素作为判定靶位点的最主要的参考依据。

2 山羊保守miRNA的鉴定

在2012年底，山羊的基因组序列组装才初步完成，其基因组序列信息仍不完整[11]。所以之前关于山羊miRNA方面的研究极大地受限，并多参考牛和绵羊的基因序列信息和miRNA数据库信息。牛、绵羊和山羊之间的亲缘关系最近，均属牛科动物。一般认为绵羊和山羊都是由共同的祖先进化而来的，在长期的遗传进化过程中发生了罗伯逊易位造成绵羊的染色体减少了6条[12]。Jillian等[13]研究表明牛、山羊和绵羊的染色体差别可能是由于染色体重组造成的。沈祖楠等[14]研究表明牛和山羊染色体同源性较绵羊和山羊，牛和绵羊的高。以上研究表明，绵羊和山羊是由共同的祖先进化而来，但由于染色体的易位或重组导致绵羊与山羊遗传物质的同源性稍差于山羊与牛的同源性。选择牛或绵羊的基因组和miRNA数据库作为参考来鉴定山羊的miRNA是可行的。此外，由于绵羊的基因组没有牛的基因组完整，miRNA数据库也是如此。在牛的miRBase (20.0)数据库里，牛有798个miRNA前体和783个miRNA成熟体，而绵羊则有105个miRNA前体和153个miRNA成熟体。所以以牛的基因组和miRNA数据库作为参考相对多一些[15-19]。

3 miRNA参与乳腺发育

撒哈拉的古壁画显示，早在公元前4000年，奶和奶产品已经成为人类的重要食物来源。羊奶具有很高的营养价值，不含过敏原，营养成分均衡，易消化吸收，与人乳蛋白质组成相似，特别适宜于病人、婴幼儿及老年人饮用，因此山羊奶是最符合人类需求的功能性保健食品[20]。对哺乳动物来说，乳腺是唯一一个成年后可以继续生长发育的动态变化的器官。乳腺的形成开始于胚胎期，胚胎期是乳腺发育的最早期阶段。在山羊的泌乳过程中经历四个阶段：泌乳初期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期。在四个主要时期：乳腺发生深刻形态变化和功能分化[21]。这些变化对应着细胞增殖、凋亡、分化和基因表达的变化模式改变[22-24]，并决定着一系列的细胞命运[25]。因此，寻找调控这些过程的miRNA对于研究乳腺发育和乳的合成具有深刻的理论和实践意义。Brinker等[26]首次利用miRNA芯片扫描人的全基因组的miRNA，其中在乳腺组织中鉴定了23种miRNA，相对其他21个组织中来说，乳腺组织中的数目是比较少的。这项富有科学创新性和前导性的研究为研究miRNA对乳腺发育的调控奠定了基础和拉开了序幕。随后关于研究调控乳腺发育的miRNA如同雨后春笋。

目前，关于奶山羊乳腺miRNA调控泌乳的相关研究报道很少[15-17,27-29]。2010年Zidi等[27]报道山羊casein基因的单碱基突变破坏了miR-101的靶位点，从而降低了miR-101对casein基因抑制效应。2012年，林先滋等[29]通过重组腺病毒Ad-pri-miR-200a在西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达的体系，发现miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。同年，林先滋等[28]筛选出9种可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢的miRNA。2012年，Ji等[16]对西农萨能奶山羊干奶期和泌乳高峰期乳腺组织的miRNA转录组进行了比较研究，发现差异表达的miRNA中包括346种保守的miRNA和95种新的miRNA，其中，表达差异倍数最高的miRNA分别是miR-288, miR-451, miR-2478, miR-199b, miR-128, miR-25, miR-145, miR-98, miR-222, miR-181b, miR-199a-3p, miR-93, miR-21, let-7b, let-7c。2012年，Ji等[16]以崂山奶山羊为研究对象，发现泌乳初期乳腺中存在300种已知的miRNA，15种miRNA*，131种新的miRNA，其中miR-143表达量最高，高表达let-7家族含有9种不同的成员，另外，表达丰富的22种miRNA家族成员还有miR-10, miR-15, miR-21, miR-27, miR-29, miR-30, miR-92, miR-99, miR-106, miR-126,miR-132, miR-146, miR-151, miR-181, miR-193, miR-196, miR-197, miR-199, miR-200,miR-369, miR-424,miR-425；同年，Ji等[15]比较崂山奶山羊泌乳中期和泌乳后期乳腺差异表达情况，发现了1113种保守miRNA和31种新miRNA，其中，697个保守的miRNA表达差异显著，包括272个具有上调功能的miRNA和425个具有下调功能的miRNA，还揭示了这两个不同泌乳阶段中共表达最丰富的10种miRNA(miR-143，miR-143-3p，miR-138a-3p，let-7-5p，let-7b，let-7b-5p，miR-30a，miR-30a-5p，miR-738e，miR-378d)。在奶山羊乳腺miRNA的研究中，尽管Li等和Ji等研究小组都对奶山羊特定泌乳阶段乳腺miRNA的表达谱进行了研究，但结果仍然存在很大的差异，比如：从已知两个不同奶山羊品种不同时期miRNA表达丰度分析，差异表达miRNA种类和表达水平不一致，可能与不同品种的遗传背景有关，也可能与miRNA所具有的时空特异性有关。

4 miRNA参与肌肉发育

山羊作为主要的肉品提供者，尤其在穆斯林地区。因此，人们着重关注的就是山羊的肉品质及肌肉的发育调控，肌肉形成是成肌细胞退出细胞周期、表达肌肉特异性基因并阻止其它细胞或组织特异性基因表达的一个过程。尽管肌肉的分子发育机制一直是发育生物学的重点研究对象，然而对重要功能基因和各调节因子实施精确调控的分子机制和转录后水平的调控网络有待进一步探明。miRNA的发现为研究基因调控提供新途径和新的视角。近来的研究表明，由基因组中非蛋白质编码区或内含子编码的miRNA参与了骨骼肌的增殖与分化调控过程[30-31]。通过功能缺失和获得试验发现了miR-1、miR-133、miR-206等一类miRNA在肌肉组织中特异表达，特别是在骨骼肌和心肌中扮演着十分重要的角色[32-33]。

Clop等[34]发现myostatin基因的3’UTR发生一个G-A的突变，结果产生一个miR-1和miR-206的识别位点，而miR-1和miR-206在骨骼肌中高丰度表达，进而抑制了myostatin基因表达，导致肌肉过度生长形成肌肉肥大表型双肌臀特克塞尔羊。Caiment等[35]通过高通量测序技术对4种不同CLPG基因型绵羊骨骼肌中的miRNA进行测序分类，结果发现有110个miRNA作用于控制美臀表型的基因区域。在山羊上肌肉组织中的miRNA研究报道比较少，韩志玲等[36]利用qPCR的方法证明miR-1、miR-133、miR-24、miR-122、miR-103、miR-143和let-7在成羊中的表达量均高于羔羊，其表达量还受性别的影响。凌英会等[37]利用Solexa方法进行测序并经生物信息学分析山羊背最长肌组织中miRNA表达情况，共鉴定出517个物种间保守的和2个山羊基因组特有的miRNA。然而关于山羊肌肉组织的miRNA调控的靶基因和作用机制与其它物种是不是一样？目前缺少进一步的研究。

5 miRNA参与皮肤毛囊发育

羊毛具有弹性好、吸湿性强、保暖性好等优点，是纺织工业的重要原料。毛囊是皮肤的附属结构，由上皮细胞和真皮细胞间相互作用发育形成，毛发都由毛囊产生。在哺乳动物的整个生命过程中，毛囊反复经历着生长期、退行期和休止期三个时期交替的变化过程[38]。在毛囊的周期性变化过程中，相关基因的表达也受着多种调控因子的调控。miRNA是一类重要的转录水平的调控因子。研究表明miRNA在毛囊发育过程中发挥着重要的作用。

Zhang等[39]利用芯片技术和生物信息学技术比较了内蒙古绒山羊和美利奴绵羊在耳尖和体侧区皮肤组织中的表达差异miRNA，结果发现159个miRNA在山羊和绵羊这两处皮肤表达，其中有19个miRNA在体侧皮肤区特异表达或高丰度表达，miRNA靶基因的生物信息学分析表明有15个miRNA可能在毛囊发育中的上调作用或者直接靶向Wnt信号阻断通路。唐晓惠等[40]研究miR-184及miR-205在绵羊毛囊发育过程中表达变化规律，发现从毛囊生长期到衰退期miR-184的表达量呈逐步上升，而miR-205则表现为先上升后下降,其在衰退期表达量最高。通过生物信息学预测发现这两个miRNA的靶基因富集Wnt通路。唐晓惠等[41]用qPCR的方法研究miR-31从绵羊毛囊的生长期到休止期的表达量逐渐下降，并预测KRT17可能是其靶基因。在山羊上关于miRNA参与毛囊发育也陆续有报道：尹俊等[42]构建了70 d胎儿皮肤小分子RNA文库，鉴定32个山羊的miRNA。尹俊等[43]用Exiqon miRNA8.1表达谱芯片筛选70 d胎儿皮肤和出生两周羊羔体侧部皮肤组织中的差异表达的miRNA。结果发现相对绒山羊70 d胎儿皮肤上调的有64个miRNA，下调的有4个miRNA。相比其前次试验鉴定miRNA的数量要多一倍。Liu等[18]利用高通量测序在内蒙古白绒山羊皮肤组织中 鉴定了316个miRNA和22个新的miRNA，68个在山羊上是保守的在NCBI数据库里面报道过。248个是保守的在其它物种但没有在山羊上报道过。发现山羊与绵羊共表达的miRNA位于相同的染色体位置，表明这些miRNA是必要的对于毛囊和皮肤发育来说。Yuan等[44]利用Solexa测序在陕北白绒山羊皮肤组织中鉴定了399个保守miRNA和172新的miRNA，其中326在生长期、退行期和休止期均表达。有26个只在生长期表达；41个只在退行期表达和55个只在休止期表达。GO分类和KEGG通路分析结果发现，23.08%的靶基因富集到新陈代谢通路、癌症通路、MAPK信号通路、内吞作用和粘着，这些靶基因也富集到278种生物学功能，提示这些通路可能在毛发循环过程中扮演着非常重要的角色。

6 miRNA参与繁殖机能

家畜的繁殖性状是重要的经济性状之一，尤其对于山羊来说其繁殖成本占总生产成本的60%～70%。因此，研究山羊性腺组织miRNA表达情况对于进一步揭示其在山羊卵泡发育、激素分泌等生殖活动中的作用及机理具有重要意义，然而这方面的报道屈指可数。

张晓东等[45]应用Solexa测序技术挖掘山羊卵巢组织miRNA，结果发共鉴定出508个山羊卵巢组织表达的miRNA，其中444个属于195个miRNA家族，64个不属于任何家族，并证明这些miRNA哺乳动物进化过程中是高度保守的。测序结果中表达量位于前10 位的miRNA 依次为：let-7b、let-7a、let-7c、let-7f、miR-320、miR-199c、miR-199、miR-140、miR-140-3p和miR-199b*。同年，Zhang等[19]进一步鉴定了怀孕的卵巢组织与未怀孕的卵巢组织中miRNA，共鉴定了617个保守miRNA和7个新的miRNA，其中471个共表达于两个组织。90个只在怀孕的卵巢组织中表达，56个只在未怀孕的卵巢组织中表达。相对于未怀孕的卵巢组织294个上调，113个下调。进一步分析预测miR-143的靶基因为Frizzled-6和Frizzled-3受体基因，这两个基因位于Wnt/β-catenin信号通路，从而参与繁殖调控。

7 小 结

随着新一代高通量测序的成熟和普及，利用这项技术鉴定和筛选山羊乳腺组织、肌肉组织、毛囊皮肤组织和卵巢组织中的miRNA的研究报道越来越多，文章多集中在2012年和2013年。鉴定发现了大量的山羊miRNA也取得了不少成果。在山羊基因组信息还不完整背景下，山羊miRNA的鉴定与筛选已远远走前面。然而这些研究大都仅仅停留在鉴定和筛选的层面，关于与目标性状密切相关的具体miRNA的靶基因及其调控机制还不清楚，研究也非常欠缺。当然这一点既是重点，也是难点。因为只有我们把具体的miRNA的靶基因找到，才能阐明miRNA调控性状的分子机制。

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