盐酸纳美芬对大鼠颅脑创伤后Survivin表达的影响

张兴超，张绍政，彭龙锋，曲绍霞，姜京超，高培龙

生存素(Survivin)是近来新发现的一种凋亡抑制基因，在正常成人组织中不表达，而在颅脑损伤后高表达，具有抑制细胞凋亡的作用［1］。盐酸纳美芬在颅脑创伤后具有神经保护作用，但其机制尚不清楚［2］。本研究采用自由落体法大鼠颅脑创伤模型，观察盐酸纳美芬对大鼠颅脑创伤后伤侧脑组织Survivin、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达和细胞凋亡的影响，以探讨其发挥神经保护作用的可能机制。

材料与方法

1 主要仪器和试剂

Epics XL流式细胞仪(美国Becman-Coulter公司)，BI2000图像分析系统(成都泰盟科技有限公司);Caspase-3 P20多克隆抗体(兔抗)、Survivin多克隆抗体(兔抗)为Santa Cruz公司产品，SP试剂盒(抗兔IgG)和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，盐酸纳美芬注射液(成都天台山制药有限公司，国药准字H20080645)。

2 实验动物及分组

选取健康雄性Wistar大鼠，无特定病原体(SPF)级，体质量(260±20)g［由甘肃省中医学院动物实验中心提供，动物质量合格证号为SCXK(甘)2004-007］，随机分为假手术组(6只)、颅脑创伤组(36只)及纳美芬治疗组(36只)。假手术组在伤后1d取材，余两组均在伤后1、2、3、5、7、14d分别取材，每时间点各6只。

3 动物模型的建立

采用Feeney法制作颅脑创伤模型［3］。实验动物用戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，沿中线切开头皮，剥离骨膜，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后1.5mm、中线旁2.5mm处钻孔并扩大为一直径5mm骨窗，保持硬膜完整。用40g砝码分别于25cm高处沿外周导管坠落，致右顶叶脑挫裂伤，硬膜外置明胶海绵止血，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。按分组规定的时间点断头取脑。假手术组除不打击外，其它步骤同上。治疗组于颅脑创伤后立即一次性皮下注射盐酸纳美芬(0.1mg/kg)［4］。

4 免疫组织化学技术检测Survivin、Caspase-3表达

大鼠断头取脑，用4%中性多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，以视交叉和乳头体中部为切面行冠状切片，片厚5μm。采用SP法检测Survivin和Caspase-3的表达(按SP法步骤进行)，阴性对照为不加一抗。在光镜下观察Survivin、Caspase-3免疫反应的结果，阳性染色定位于胞浆和(或)核膜，呈黄色。采用BI-2000图像分析系统进行图像定量分析。Survivin和Caspase-3免疫组化染色标记强度用光密度值(optical density，OD)表示，比较各组OD值。

5 流式细胞仪检测神经细胞凋亡

取损伤灶处新鲜脑组织约100～150mg，于磷酸缓冲液(PBS)中匀浆，匀浆后组织用400目筛网过滤，滤液放离心管中，1000r/min离心5min，PBS洗2次，再加70%乙醇固定，4℃过夜。次日离心去上清，PBS洗1次，加1ml碘化丙啶(PI)染液(浓度为50μg/ml，含生理盐水32.4ml，PI 2.5mg，核糖核酸酶(Rnase)0.5mg，聚乙二醇辛基苯基酸(Triton-X-100)0.25ml，枸橼酸钠50mg，加蒸馏水至50ml)，4℃避光条件下染色30min。应用Epics XL流式细胞仪记录氩离子激发光波长488nm处红色荧光，每个样本计数10 000个细胞，以细胞凋亡的百分率为检测指标。

6 统计学处理

结 果

1 神经细胞凋亡率的变化

颅脑创伤组各时相点神经细胞凋亡率均较假手术组增高，伤后2d达高峰，此后逐渐下降，但直至伤后14d仍显著高于假手术组水平(P＜0.05)。纳美芬治疗组各时相点细胞凋亡率较颅脑创伤组均明显降低(P＜0.05)(见图1、表1)。

2 Survivin、Caspase-3蛋白表达的变化

颅脑创伤后3d在伤侧脑组织中可见Survivin少量表达，7d达高峰，3、5、7、14d组与假手术组比较均有显著性差异(P＜0.05);纳美芬治疗后1d即见Survivin表达，之后表达明显增加，5d达高峰，与颅脑创伤组各时相点相比，Survivin表达均显著升高(P＜0.05)(见图2、3)。Caspase-3在伤后1d达高峰，后逐渐下降，14d时仍显著高于假手术组(P＜0.05);纳美芬治疗组各时相点伤侧脑组织Caspase-3表达较颅脑创伤组均明显降低(P＜0.05)(见图4、5)。

表1 纳美芬治疗前后不同时间点伤侧脑组织神经细胞凋亡率(±s，%)

表1 纳美芬治疗前后不同时间点伤侧脑组织神经细胞凋亡率(±s，%)

与假手术组比较:*P＜0.05;与颅脑创伤组比较:ΔP＜0.05

组别1d 2d 3d 5d 7d 14d假手术组2.16±0.63颅脑创伤组 19.68±0.59* 22.76±1.86* 18.90±1.41* 15.8±1.51* 13.42+1.07* 11.76±1.54*纳美芬治疗组 15.34±1.12*Δ19.00±0.73*Δ14.14±0.88*Δ12.78±0.83*Δ10.78±0.79*Δ 9.26±1.30*Δ

图1 流式细胞仪直方图

图2 伤后5d Survivin蛋白阳性表达(SP×400)

图3 各组不同时间点Survivin蛋白表达变化

图4 伤后1d Caspase-3蛋白阳性表达(SP×400)

图5 各组不同时间点Caspase-3蛋白表达变化

讨 论

创伤性颅脑伤是临床常见的致死性疾病之一，病理生理机制非常复杂，对人类健康危害极大，主要原因是继发性脑病理改变，而颅脑损伤后的神经细胞凋亡促进了继发性脑损害的发展，导致病人预后不良［5］。因此，抗神经细胞凋亡成为创伤性颅脑伤救治的重要方面。

Caspase-3的激活是凋亡级联反应中的关键步骤，它的活化参与了脑缺氧缺血损伤后神经细胞的凋亡，并对决定细胞凋亡下游事件的激活起重要作用［6］。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中的一个新成员，它是用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA从人类基因组库的杂交筛选中将其分离出来，位于染色体17q25，其蛋白含有142个氨基酸。Survivin在正常分化成熟组织中不表达，而在大多数肿瘤组织及颅脑创伤后存在高表达，并发现其主要通过直接抑制终末效应酶，即Caspase-3和Caspase-7的活性来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程，发挥神经保护作用［1，7］。

纳美芬作为最新一代的阿片受体拮抗剂，能与脑内的阿片受体结合，竞争性阻断内源性阿片肽对神经细胞的损害，其可通过解除内啡呔对神经感觉及运动传导通路的抑制，降低抑制神经元兴奋性;减少自由基的产生和抗脂质过氧化作用，增加细胞膜的稳定性;抑制颅脑创伤时巨噬细胞的趋化活性，减少炎症介质的释放，减轻炎症反应;降低内皮素，提高降钙素基因相关肽水平，保护神经元;抑制兴奋性氨基酸释放及改善神经细胞内Ca2+紊乱，减轻其对神经细胞的损害作用;增加脑局部血流和脑灌注压，改善神经细胞的能量代谢，减轻脑水肿，而达到神经保护的作用［2，4，8－9］。但纳美芬是否可以通过上调Survivin蛋白表达发挥神经保护作用，国内外报道甚少。笔者通过观察纳美芬对实验性大鼠颅脑创伤后神经细胞Caspase-3和Survivin蛋白表达的影响，探讨其作用机制，为其临床应用提供依据。

本实验发现颅脑创伤后早期并无Survivin蛋白明显表达，但随着受伤时间的延长，Survivin蛋白表达逐渐增高，而纳美芬治疗使Survivin蛋白表达在伤后早期就出现，达峰时间早于颅脑创伤组，与颅脑创伤组各时相点相比，Survivin蛋白表达水平显著升高，且持续高水平表达。这说明在颅脑创伤后不但存在Survivin蛋白高表达，而且纳美芬治疗可促使其早期高水平表达。同时本实验发现纳美芬治疗组各时相点伤侧脑组织Caspase-3蛋白表达水平及细胞凋亡率较颅脑创伤组均明显降低，并通过相关性分析发现它们之间具有负相关性(r=－0.584，P=0.001)。笔者认为颅脑创伤后应用纳美芬治疗可增加抗凋亡蛋白Survivin的合成和分泌，抑制Caspase-3表达，从而阻断细胞凋亡过程，发挥脑保护作用。

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